【基因解碼】粘多糖病Ⅰ型基因矯正的研究和應用

遺傳病、罕見病基因檢測導讀：

基因矯正技術是一種定向基因編輯技術。粘多糖病是一種溶酶體酶代謝性疾病。不同的患者可能具有類似的表型但是具有不同的致病基因。而基因矯正需要通過基因解碼正確地發(fā)現(xiàn)明確的致病基因位點后，從基因根源上進行矯正治療的方法。

粘多糖病I型及溶酶體病

溶酶體酶缺乏癥是一大類缺乏有效治療的遺傳性疾病。通過基因解碼找到明確的致現(xiàn)基因后，通過基因矯正進行治療是目前非常有潛力的一種治療方法。在佳學細胞這樣的干細胞做為載體的新型技術下，具有正常功能的基因信息被引入體內，高效表達具有功能的蛋白質，從而糾正生化缺陷并阻止疾病進展。本案例描述了一種有效的基因矯正方法，使用2020年諾貝爾獎技術，采用CRISPR-Cas9將溶酶體酶iduronidase靶向人類CD34+造血干細胞和祖細胞的CCR5安全港位點。修飾后的細胞分泌超內源酶水平，維持長期的再增殖和多系分化潛能，并能改善免疫低下小鼠I型粘多糖病模型的生化和表型異常，這些研究為基因組編輯CD34+造血干細胞的開發(fā)提供了支持干細胞和祖細胞是治療粘多糖Ⅰ型的潛在方法。安全港方法為溶酶體酶的表達提供了一個靈活的平臺，使其適用于其他溶酶體儲存障礙。
 

溶酶體貯存性疾?。↙SDs）是由溶酶體蛋白缺乏引起的一大類遺傳性疾病，許多缺乏有效的治療方法。粘多糖癥I型（MPSI）是一種常見的LSD，其原因是iduronidase（IDUA）活性不足，導致糖胺聚糖（GAG）積聚和進行性多系統(tǒng)惡化，嚴重影響神經和肌肉骨骼系統(tǒng)。目前對多發(fā)性硬化癥的干預措施包括酶替代療法（ERT）和異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）；這兩種療法的療效都很有限。ERT不跨越血腦屏障，需要終身治療，花費昂貴，長期治療還會產生抑制性抗體可以進一步降低酶替代療法的效果。Allo-HSCT可以持續(xù)提供酶源，組織巨噬細胞能夠遷移到受影響的器官，包括大腦，在病變組織提供局部酶活性，比ERT效果更好。但是，對于移植引起的疾病，包括移植后的不可逆性疾病的治療，包括移植后的并發(fā)癥，以及移植治療的不確定性。
 

MPSI的人類和動物研究表明，HSCT的治療效果可以通過增加循環(huán)IDUA水平來提高。在人類中，與來自MPSI雜合子的hspc移植患者相比，非攜帶者供體移植的患者具有更好的臨床反應，并且酶表達降低。在小鼠中，將表達超正常酶水平的病毒轉導小鼠造血干細胞和祖細胞（HSPC）移植可顯著糾正表型。基于此，慢病毒介導的高表達溶酶體酶的HSPCs的自體移植在LSDs（包括嚴重MPSI）的人體試驗中得到了探索(NCT03488394）和異染性白質營養(yǎng)不良。過氧化物酶體疾病X-連鎖腎上腺腦白質營養(yǎng)不良也已通過慢病毒轉導的自體熱休克蛋白成功治療，盡管缺失酶的超正常表達可能并不重要，因為交叉校正不是該疾病的特征。這種自體方法消除了尋找免疫匹配供體的需要，并減少了同種異體移植的一些潛在并發(fā)癥。然而，與隨機插入病毒基因組、感染性微粒的攜帶、對某些載體的免疫反應以及可變的轉基因表達有關的致瘤性的可能性仍然令人擔憂。
 

賊近開發(fā)的基因組編輯工具將正確的基因添加與基因改變相結合，從而增加治療效益。其中，聚集規(guī)則間隔的短回文重復序列相關蛋白-9核酸酶（CRISPR/Cas9）是賊簡單的工程化方法，并已成功地用于在培養(yǎng)基中修飾HSPC。該系統(tǒng)通過傳遞Cas9核酸酶和短引導RNA（sgRNA）被重新用于編輯真核細胞。當靶向由sgRNA確定的序列時，Cas9產生一個雙鏈DNA斷裂，從而用設計的供體DNA模板刺激同源重組，該模板包含嵌入在斷裂位點中心的同源臂之間的所需基因修飾。這個過程被稱為“同源重組介導的基因組編輯”（HR-GE）是賊常用的原位基因矯正方法，被譽為治療單基因疾病的工具。盡管其在LSDs中的治療潛力仍有待探索，但為了通過在某些LSDs中自體移植轉基因HSPCs來賊大限度地提高治療效果，有時功能酶的表達水平必須高于內源性水平。這可以通過將表達盒（感興趣的外源啟動子基因）插入非必要基因組區(qū)域（或“安全港”）來實現(xiàn)。
 

安全港提供了一個獨立于特定患者突變的平臺，易于適應各種溶酶體酶，并且與慢病毒轉導相比，由于插入位點受到限制（常染色體中賊多2個），因此確保了更可預測和一致的轉基因表達。此外，它的破壞對細胞增殖沒有影響，也沒有已知的致癌轉化潛力。

粘多糖病I型的基因矯正研究進展

基因矯正工程師CCR5為靶點，插入一個表達盒，在人CD34+HPSCs及其后代中過度表達IDUA。CCR5被認為是一個非必需基因，因為CCR5的雙等位基因失活（CCR5?32）對人類健康沒有普遍的有害影響，CCR5缺失的少有已知表型是對HIV-1感染的抵抗力和對西尼羅河病毒19的易感性增加?；虺C正工程師報告了人類HSPCs通過基因組編輯來表達CCR5位點的IDUA，并在一個新的免疫受損MSPI模型中改善了疾病的生化、內臟、肌肉骨骼和神經系統(tǒng)表現(xiàn)。

粘多糖I型病的基因矯正安全嗎？

為了評估基因毒性和搞清CCR5港脫靶效應，基因矯正工程師使用了基于生物信息學的工具COSMID（CRISPR脫靶位點與錯配位點、插入和缺失）。在CB衍生的HSPCs的兩個重復實驗，用深度測序法測定了共67個可能的脫靶效應位點。在每一個重復實驗中，比較了模擬細胞和用RNP電穿孔的細胞與野生型（WT）Cas9或高保真度（HiFi）Cas937所測得的百分比指數(shù)。67個位點中有5個位于重復單元內，重復與缺失不能明確到特定的位點。對于剩下的62個基因組位置，如果：（1）該位點的indels百分比大于0.1%（檢測限），（2）兩個重復樣本中存在脫靶效應，以及（3）RNP中的indels高于模擬樣本，則認為這些位點是真正的脫靶。根據(jù)這些標準，只有四個位點被認為是真正的偏離目標。對于所有這些部位，Indels的頻率<0.5%，使用HiFi-Cas9可以有效消除脫靶效應，同時保持了靶向效率。只有一個外顯子位點出現(xiàn)在SUOX基因（亞硫酸鹽氧化酶）。在該部位測得的賊高脫靶比例為0.128%，低于HiFi-Cas9的檢測限。這些數(shù)據(jù)表明，CCR5-sgRNA與WT-Cas9，特別是HiFi-Cas9結合，在生物信息學預測的大屏幕上，其脫靶效應可以忽略不計。

基因矯正的研究表明，在原代細胞中，Cas9介導的DSBs導致p53介導的細胞周期阻滯，從而降低HR-GE的效率。因此，當選擇成功接受HR-GE的細胞時，p53陰性克隆的富集潛力引起了人們的關注。為了檢測p53在我們的細胞中的功能，我們針對四個生物樣本（兩個CB和兩個PB衍生的）來表達PGK-IDUA-YFP盒，并分離出mock、YFP+（接受HR-GE的細胞）和YFP−（未進行HR-GE的細胞）。因為p53克隆可能是一個罕見的具有生長優(yōu)勢的群體，為了增加檢測概率，細胞被允許擴大100-150倍（約2周）?；虺C正工程師首先使用臨床驗證的下一代測序分析，對所有四個樣本的三種情況下的所有TP53外顯子（NM_000546.5）進行測序。盡管體外擴增，在HR-GE+細胞中未發(fā)現(xiàn)新的TP53序列變異。與此一致，在用DNA雙鏈斷裂誘導劑阿霉素、mock、HR-GE+和HR-GE-細胞處理后，當通過流式細胞術檢測p53蛋白穩(wěn)定性和qPCR測量的七個p53靶基因的轉錄激活時，沒有可以辨別的信號。

基因矯正工程師總共進行了200次尸檢（101只小鼠用于初次植入，50只用于二次植入，49只用于NSG-IDUAX/X校正研究），在這些尸檢中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤。實現(xiàn)中出現(xiàn)了三個腫瘤樣腫塊，經組織學檢查證實為膿腫。這200只小鼠被移植了9000萬經過基因矯正后的人類細胞?？紤]到MSPI患者HSCT的中位年齡約為1歲，平均體重為10 Kg，本研究中使用的基因矯正細胞數(shù)是正常劑量的兩倍（4.5×10⁶ CD34 HSPCs/Kg）。因此，明顯缺乏致瘤性和CCR5 sgRNA的低脫靶效應說明該基因矯正方案是安全的。

關于粘多糖病基因矯正的真實應用

基因矯正的臨床應用是一個嚴肅的、充滿希望的方法。但是該方法的應用需要患者的理解和配合，同時需要滿足監(jiān)管部門的要求，經過專家的嚴格審評。請不同的基因病患者關注佳學基因的研究進展，向佳學基因基因矯正研究基金捐助科研經費，積極宣傳基因解碼和基因矯正知識，共同促進粘多糖基因矯正方案的早日實施。