【佳學(xué)基因檢測】PKD1基因檢測與多囊腎遺傳性分析

PKD1的基因解碼

根據(jù)《人體疾病發(fā)生的基因原因分析》， PKD1是人體內(nèi)的一個結(jié)構(gòu)蛋白。除了PKD1以外，該基因還有其他的符號代碼， 它們是PBP, PC1, Pc-1, TRPP1?；蚪獯a明確負(fù)責(zé)將PKD1的基因信息傳遞給細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)生成部門的是一個由14,148堿基組成的信使核酸。它們以46 個外顯子的形式存在。這一信息是由存在于人體基因組中的長達52000個堿基對提供的?；蚪獯a還發(fā)現(xiàn)，PKD1的時空調(diào)節(jié)序列成分中的啟動子區(qū)域沒有在其他蛋白合成中普遍存在的TATA序列，但是具有 E2F、EGRF、ETS、MZF1的結(jié)合位點 、SP1 和 ZBP89。 PKD1 啟動子還包含一個 E 盒、MINI（肌肉啟動子序列）結(jié)構(gòu)域和一個 AP2 結(jié)合位點。基因解碼過程中所采用小鼠 Pkd1 啟動子的刪除研究還明確了一個能夠驅(qū)動基因表達的由280個核苷酸序列組成的時空調(diào)節(jié)片段，這一片段是時空調(diào)節(jié)和組織特異性調(diào)節(jié)的核心序列，因為額外的基因解碼證據(jù)表明，如果將研究的片段擴大到更大的區(qū)域，則驅(qū)動基因表達的活性會降低。在驗證基因解碼結(jié)果的過程中，采用分子剪刀技術(shù)，突變 280 bp 片段內(nèi)的潛在 E2f 結(jié)合位點會降低活性指標(biāo)的強度，表明 E2F 在調(diào)節(jié) PKD1 基因的細(xì)胞周期依賴性表達中的作用。 這些基因解碼結(jié)果賦予了與佳學(xué)基因?qū)KD1的基因解碼、基因檢測能力超過了PKD1的蛋白編碼序列之外。

PKD1的基因突位點

根據(jù)突變位點人工智能大數(shù)據(jù)模型分析：導(dǎo)致疾病的突變已在該基因的全長區(qū)域發(fā)現(xiàn)，如圖所示：
 

PKD1的致病性突變及可能致病的基因突變位點分布

PKD1的致病性分析

在基因解碼過程中， 基因信息破解與驗證機構(gòu)首先在人的基因組中確定了一個可以產(chǎn)生由14000個堿基組成的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞核酸序列的基因片段，該基因信息傳遞核酸序列在一個一型多囊腎疾病患者的體內(nèi)被被染色體易位破壞。 經(jīng)過進一步疾病表征和基因序列變化的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)這個多囊腎患者還患有結(jié)節(jié)性硬化癥 (TSC2; 191092)。致病原因可以歸結(jié)到患者體內(nèi)的基因組序列的同一坐標(biāo)區(qū)域。 佳學(xué)基因的致病基因鑒定分析表明，該患者的母親的染色體存在一種稱之為平衡易位46,XX t(16;22)(p13.3;q11.21)的染色體突變。由于婚前孕基因檢測的重要性未被認(rèn)識到，這一致病性突變被傳遞給了她的女兒，形成了本案例中的致病基因。由于同樣的原因，該對夫妻的兒子存在45,XY 核型不平衡，具有 16pter-p13.3 和 22pter-q11.21 的單體性。使得該家庭的男性后代具有結(jié)節(jié)性硬化癥的臨床表型，這是因為位于16p13.3內(nèi)的TSC2基因座在不平衡核型中被刪除。 平衡易位母女均具有一型多囊型腎?。≒KD1）的臨床特征，而母親的父母也就是患者的姥爺、姥姥染色體基因檢測結(jié)果常，無結(jié)節(jié)性硬化癥臨床特征，超聲檢查無腎囊腫。 平衡易位中斷點的位置靠近 TSC2 基因座超過 20 kb。 基因解碼分離出一個跨越斷點的基因并將其命名為 PBP（“多囊斷點”）。 然后確定了其他I型多囊型腎病（PKD1）患者的 PBP 基因的突變情況。 發(fā)現(xiàn)的先進個突變是 PBP 基因 3-引物末端內(nèi)的 5.5-kb 基因組缺失，該缺失突變存在于另一個患者及其父親體內(nèi)。檢測到的第二個重排是 PBP 基因內(nèi)的 2 kb 基因組缺失，發(fā)現(xiàn)其具有 446 bp 的移碼缺失（在堿基對 1746 和 2192 之間）。 這是一個新發(fā)突變。 對第三名患者的基因組 DNA 測序表明，在 135-bp 外顯子 (601313.0001) 之后的剪接供體位點的 +1 位置發(fā)生了 G 到 C 的轉(zhuǎn)變。 剪接缺陷導(dǎo)致 PBP 轉(zhuǎn)錄本（堿基對 3696 至 3831）中 135-bp 的框內(nèi)缺失。 第 4 名患者的 TSC2 基因和 PKD1 基因均發(fā)生缺失。 進一步的研究表明，缺失延展了大約 100 kb，并且缺失的大部分（如果不是全部的話）是PKD1 基因。佳學(xué)基因采用“動物園印跡”技術(shù)，證明 PKD1 基因在哺乳動物物種廣泛存在，且序列保守，證明其結(jié)構(gòu)與功能對所有哺乳動物的重要性。檢測的哺乳動物包括馬、狗、豬和嚙齒動物。關(guān)于PKD1基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致病疾病的發(fā)生，在基因解碼的致病性機理中存在三種用以說明常染色體顯性遺傳的機理， 這包括單倍劑量不足、功能獲得性突變（包括顯性負(fù)效應(yīng)）和二次命中機制（需要第二次體細(xì)胞突變） 產(chǎn)生有缺陷的細(xì)胞。

基因解碼還發(fā)現(xiàn) PKD1 基因座周圍的區(qū)域異常富含 CpG 二核苷酸。 為了尋找多囊腎病的突變基因，基因解碼在位于 PKD1 基因座側(cè)翼且相距小于 750 kb 的 2 個標(biāo)記之間的區(qū)域中的 CpG 島中發(fā)現(xiàn)富含多囊性腎病的致病基因突變。在這一區(qū)域中，存在的一個基因ATP6C (108745) 是從 HeLa 和培養(yǎng)的囊性腎上皮細(xì)胞 cDNA 文庫中分離出來的。 它編碼由 155 個氨基酸組成的具有 4 個跨膜結(jié)構(gòu)域的肽。 在所有測試的組織中都發(fā)現(xiàn)了指導(dǎo)這一蛋白質(zhì)多肽生成的基因信息傳遞核酸序列mRNA，但在大腦和腎臟中賊為豐富。該氨基酸序列有與液泡 H(+)-ATP 酶的部分質(zhì)子通道有 93% 的相似性。 由于突變質(zhì)子通道在囊腫病發(fā)病機制中的可能作用，基因解碼對受影響個體的兩個等位基因?qū)?yīng)的 cDNA 進行了測序，但發(fā)現(xiàn)氨基酸序列沒有差異。 此外，轉(zhuǎn)錄物大小和豐度在囊性腎中沒有改變。因此，基因解碼將進一步尋找該序列與多囊腎疾病發(fā)生有關(guān)與無關(guān)的證據(jù)。

佳學(xué)基因分析多囊腎患者的致病基因突變的過程中，對該基因 3 個主要部分的 3 個區(qū)域的分析揭示了由機制發(fā)生的 2 個突變。 兩者都是同一個75-bp 內(nèi)含子中發(fā)生的缺失（18 或 20 bp），盡管這些缺失沒有破壞內(nèi)含子邊界的剪接供體或受體位點，但它們?nèi)匀划a(chǎn)生了基因信息傳轉(zhuǎn)錄本的異常剪接。 每種情況都產(chǎn)生了兩個不同的蛋白質(zhì)合成指導(dǎo)信息鏈； 一個具有正常刪除的內(nèi)含子，而另一個由于5‘端隱含剪接體的存在，包含了應(yīng)當(dāng)刪除的 66 bp 的序列。 缺失突變基因不能指導(dǎo)產(chǎn)生正常的功能蛋白質(zhì)，從而為基因解碼的結(jié)果解釋提供證據(jù)。刪除使內(nèi)含子太小而無法使用真實的剪接位點進行剪接體組裝?；蚪獯a還在內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了一個 9-bp 的直接重復(fù)序列，這可能通過促進序列錯位來促進內(nèi)含子缺失。

ADPKD 的特征是在腎臟以外的各種器官（包括肝臟和胰腺）中逐漸形成囊腫。 基因解碼使用ADPKD 供體肝囊腫的 DNA發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)體細(xì)胞突變（移碼、無義密碼子、嚴(yán)重剪接突變和雜合性缺失）在肝囊腫中很常見。 所有的致病突變都被證明改變了該基因以前的正常拷貝。 這些數(shù)據(jù)進一步驗證了基因解碼提出的關(guān)于囊腫(cystogenesis)雙重打擊模型，這也可以說明疾病中的第二病灶產(chǎn)生的原因。

PKD1 基因的獨特結(jié)構(gòu)特征是其易變性的原因。 PKD1 基因的內(nèi)含子 21 中有一個極其不尋常的 2.5-kb 多嘧啶束，它會導(dǎo)致基因的突變率增加。多嘧啶束可能在其轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)中導(dǎo)致持續(xù)錯誤，從而導(dǎo)致高頻率的體細(xì)胞突變。 因此，從單個腎臟病變的水平來看，PKD1 是一種隱性疾病。

PKD1基因檢測篩查多囊性突變

PKD1 基因的突變篩選基因檢測比較困難的原因在于，所需要檢測的區(qū)域超過14000個核苷酸，而且在同一染色體上，編碼蛋白質(zhì)超過75%的區(qū)域反復(fù)出現(xiàn)。重復(fù)區(qū)域之間的序列相似性使得突變位點的定位和明確變得非常困驗?；蚪獯a首先在 PKD1 的獨特 3-prime 區(qū)域中識別出突變。佳學(xué)基因開發(fā)的錨定 RT-PCR 方法使用位于單拷貝區(qū)域內(nèi)的 1 個引物和重復(fù)區(qū)域內(nèi)的 1 個引物來擴增 PKD1 的特定重復(fù)區(qū)域，解決了很多檢測機構(gòu)所面臨的技術(shù)困難。

試圖對 PKD1 基因進行完整突變分析的面臨的一個主要挑戰(zhàn)是存在幾個同源位點，這些位點也位于 16 號染色體上。因為 PKD1 及其同系物的序列在 5-prime 區(qū)域幾乎相同，大多數(shù)傳統(tǒng)的突變分析方法無法區(qū)分 PKD1 中少有出現(xiàn)的序列變異。盡管連鎖信息表明 PKD1 中的突變約占所有常染色體顯性 PKD 的 85%。但是自從PKD1基因被證明是多囊性腎病1型的致病基因以來，數(shù)據(jù)庫記載的致病基因突變?nèi)匀惠^少，并且大多數(shù)都聚集在該基因的獨特部分。該基因長度的大約 70% 存在于 16p13.1 的至少 3 個忠實拷貝中。 重復(fù)區(qū)域從外顯子 1 延伸到內(nèi)含子 34，包括所有插入序列。 PKD1 拷貝被轉(zhuǎn)錄，但它們各自的 mRNA 分子可以根據(jù)大小與真實的 PKD1 轉(zhuǎn)錄物區(qū)分開來。 此外，平分 PKD1 的內(nèi)含子 21 是一個不尋常的約 2.5 kb 的多嘧啶片段。 該元素也存在于 PKD1 同系物中。

為了通過基因檢測檢查分析 PKD1 的重復(fù)區(qū)域，佳學(xué)基因設(shè)計了一種新策略，該策略依賴于遠(yuǎn)程 PCR 和來自基因獨特區(qū)域的單個基因特異性引物，以擴增跨越外顯子 23 到 34 的 PKD1 特異性模板。這個 10-kb 模板，從 基因組 DNA，可用于使用范圍廣泛的基于序列的方法進行突變分析。 Watnick 等人使用這種遠(yuǎn)程 PCR 策略通過異源雙鏈分析篩選序列變異。 (1997) 確定了幾個在外顯子 23 和 25 中具有堿基對替換簇的受影響個體。在 2 名患者中，這些在外顯子 23 中確定的變化預(yù)計會導(dǎo)致蛋白質(zhì)短鏈中的多個氨基酸替換。 這種不尋常的堿基對替換聚類表明突變可能是由 PKD1 基因的獨特結(jié)構(gòu)特征引起的。 腎囊腫是由體細(xì)胞突變引起的觀察結(jié)果以及遺傳性多囊腎病中由此暗示的高頻率“二次打擊”也表明了一種不尋常的突變機制。 瓦特尼克等人。 (1997) 觀察到 PKD1 基因在 1、21 和 22 內(nèi)含子中有 3 個長的多嘧啶片段，其中賊長的是 2.5 kb 在內(nèi)含子 21 中。內(nèi)含子 21 中的片段是當(dāng)時測序的賊長多嘧啶片段，包含 23 主干長度至少為 10 個核苷酸的鏡像重復(fù)。 他們預(yù)測，在適當(dāng)?shù)臈l件下，鏡像重復(fù)很可能形成由三螺旋構(gòu)象組成的 H-DNA 結(jié)構(gòu)。 三螺旋結(jié)構(gòu)可以促進培養(yǎng)細(xì)胞的局部誘變。 簇狀多堿基對替換的不尋常模式與與三螺旋形成相關(guān)的模式一致。

多囊性腎病的致病基因鑒定基因解碼的檢測范圍及檢出率

在采用以全外顯測測序為檢測范圍、以基因解碼分析技術(shù)為基因突變注釋的雙盲臨床實驗中，收納了174172 名患者（中位年齡，60 歲；60.6% 為女性），303 名患者經(jīng)過臨床診斷指標(biāo)確診為ADPKD，其中 235 名患者有明確的診斷依據(jù)記錄。 除 PKD1 和 PKD2 外，IFT140、GANAB 和 HNF1B 中的功能喪失突變(LOF)在多重比較校正后被確定與ADPKD 診斷相關(guān)，而這些基因在很多基因檢測包和基于數(shù)據(jù)庫比對的基因檢測中未被納入。 在 PKD1 有功能喪失突變（LOF)變異的患者中，68 名患者中有 66 名 (97%) 患有 ADPKD； 在 PKD2 中具有功能喪失突變（LOF)的 43 名患者中有 43 名 (100%) 患有 ADPKD。 揭示出這一類突變的高發(fā)病率及高穿率。相比之下，之前被數(shù)據(jù)庫標(biāo)定為“可能致病”的 PKD1 錯義變異的 77 名患者中只有 24 名 (31.2%) 患有 ADPKD，基因解碼認(rèn)變這可能是分類錯誤、也可能是這些突變引起的致病性可以受其他基因或者是外界環(huán)境的影響。在通過臨床表征審核組審定的ADPKD 診斷患者中，235 名患者中有 180 名 (76.6%) 通過致病基因鑒定基因解碼找到了潛在的遺傳原因，其中大多數(shù)是在 PKD1（127 名患者）或 PKD2（34 名患者）上存在基因突變，這也是為什么對于價格敏感患者，佳學(xué)基因推薦進行這兩個基因的全檢測的原因。235 人中有 19 人 (8.1%) 在與囊性腎病相關(guān)的其他基因中存在變異，因此如果檢則是為了追求高檢出率，應(yīng)當(dāng)遵循佳學(xué)基因遺傳咨詢師的推薦。在這 235 名確診的 ADPKD 患者中，150 名 (63.8%) 有 ADPKD 家族史。 與沒有家族史的患者相比，具有 ADPKD 家族史的患者的 ADPKD 的找到致病基因的比率更高（91.3% [137/150] 對 50.6% [43/85]；差異，40.7% [95% CI， 29.2%-52.3%]；P < .001）。在這一雙盲對照實驗中， 在其他基因檢測機構(gòu)中未檢出的 PKD1、PKD2 和 GANAB 基因突變，結(jié)過基因解碼技術(shù)進行鑒定，證實了致病性。