國家藥監(jiān)局
關(guān)于發(fā)布腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑和CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑
2項注冊技術(shù)審查指導原則的通告

（2019年 第83號）

為加強醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊工作的監(jiān)督和指導，進一步提高注冊審查質(zhì)量，國家藥品監(jiān)督管理局組織制定了《腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價通用注冊技術(shù)審查指導原則》和《CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則》，現(xiàn)予發(fā)布。

特此通告。

國家藥監(jiān)局2019年11月12日

腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑（高通量測序法）

性能評價通用技術(shù)審查指導原則

 

一、前言

本指導原則旨在指導注冊申請人對腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導原則是針對腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細闡明理由，并對其科學合理性進行驗證，提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

二、適用范圍

本指導原則所述腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價主要是指基于高通量測序（high-throughput sequencing）即下一代測序（next generation sequencing,  NGS），又稱為大規(guī)模平行測序（massively parallel sequencing, MPS），體外檢測人體組織中腫瘤細胞中腫瘤相關(guān)基因變異。用于檢測體細胞突變的NGS正在廣泛用于腫瘤診療相關(guān)的分子檢測，包括對特定基因的DNA/RNA進行測序，以尋找與腫瘤臨床診療相關(guān)的突變基因的改變。腫瘤基因突變類型包括點突變、插入、缺失、基因重排、拷貝數(shù)異常等廣義的基因突變。

基于NGS測序原理的IVD檢測可能包括以下步驟：樣本收集，處理和保存、DNA提取、DNA處理、文庫制備、測序和堿基識別、序列比對/映射、變異識別和過濾、變異注釋和解讀以及檢測報告的生成。同時，某些產(chǎn)品還可能會包括軟件部分，但上述相關(guān)步驟并不一定被全部包括，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的具體設(shè)計流程來進行判斷。對于每個檢測步驟，申請人需要結(jié)合產(chǎn)品設(shè)計和臨床意義來建立特定的可接受的質(zhì)量評價指標和合格判斷標準。此外，為滿足產(chǎn)品特定預期用途，申請人需通過科學和適當?shù)臋z測性能研究來確定適用的試劑，消耗品，儀器和軟件。基于上述考慮因素，NGS檢測產(chǎn)品的設(shè)計和工作流程中的任何差異均可能導致結(jié)果的不同，因此申請人需要清楚地描述相關(guān)檢測性能指標。

分析性能評價的初衷在于提出產(chǎn)品性能有效性、安全性相關(guān)問題的假設(shè)，然后通過研究進行確認。NGS在測序通量及發(fā)現(xiàn)未知基因變異方面具有優(yōu)勢，但是在NGS技術(shù)應(yīng)用需求及使用中存在包括相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測內(nèi)容、測序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告、技術(shù)質(zhì)量認證和驗證等各方面的挑戰(zhàn)。

本指導原則將重點關(guān)注實體瘤中檢測具有臨床意義的體細胞變異和確保高質(zhì)量的測序結(jié)果。申請人應(yīng)以患者的利益為中心，充分整合臨床腫瘤學家對于正確診治的觀點，并充分考慮在我國推廣應(yīng)用的可操作性。申請人可采用多樣化的靶向基因組合檢測。由靶向基因組產(chǎn)生的信息可能會被用于診斷分類，指導治療決策，和/或為特定腫瘤提供預后評價，不同產(chǎn)品包含的基因數(shù)量可能存在較大差異。

本指導原則適用于進行新穎注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。本指導原則不適用于基于胚系來源檢測,全外顯子檢測，腫瘤突變負荷（TMB）檢測，非靶向測序，從頭測序、微生物感染輔助診斷、游離DNA檢測、直接面向消費者測序、胎兒檢測、微生物基因組鑒定和藥物耐藥性檢測、胚胎植入前檢測、疾病風險（含遺傳風險) 評估與預測、RNA直接測序、篩查、獨立診斷目的、腫瘤基因組測序、健康個體測序檢測。

三、NGS性能評價

(一)綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。

作為IVD檢測一般原則，申請人應(yīng)首先定義申報產(chǎn)品的預期用途和檢測性能，產(chǎn)品的預期用途將直接影響檢測設(shè)計和檢測性能以及測序和/或報告的基因類型。申請人需要前瞻性地確定應(yīng)進行的研究指標（例如正確性）以及每種研究指標應(yīng)該滿足的標準。在設(shè)計和開發(fā)完成之后，驗證研究其是否滿足預定義的性能。如果檢測不符合任何預定義的性能標準，則應(yīng)該修改并重新驗證。通過反復的設(shè)計，開發(fā)和驗證，直到檢測滿足設(shè)定需求。在整個過程中，申請人需要記錄所有研究方案，研究過程和結(jié)果，以及每項研究設(shè)計的理由。申請人應(yīng)列出檢測樣本水平相關(guān)參數(shù)，建議以列表形式明確，詳見附表1

申請人應(yīng)提供整個檢測流程SOP文件，對NGS技術(shù)檢測全過程包括的樣本收集處理、文庫制備、測序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告等過程進行詳細描述。生物信息學分析方面描述和記錄數(shù)據(jù)處理和分析，包括變異識別，過濾和注釋的所有過程。明確所有要使用的軟件，包括來源（例如，內(nèi)部開發(fā)的以及第三方的）以及任何修改。建議以列表形式描述所有需要的軟件和/或數(shù)據(jù)庫名稱及其功能。

申請人在計劃開發(fā)一個有針對性的基因檢測試劑時，需確定其預期用途和待測基因數(shù)量，包括將要檢測的樣本類型、適用人群以及哪些類型的檢測信息將被評估和報告。還應(yīng)考慮影響檢測的設(shè)計，驗證和質(zhì)量控制的其他因素。并在試劑組成說明書中應(yīng)詳細說明該產(chǎn)品包含的試劑組分及需要但未提供的試劑、設(shè)備及耗材。

（二）主要原材料的研究資料

NGS檢測過程主要包括樣本收集處理、文庫制備、測序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告等。

1.樣本收集處理（如適用）

樣本收集處理過程是高效樣本具有能如實反映患者體征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。申請人需提交涉及樣本收集及處理相關(guān)試劑主要原材料信息，如樣本的運輸保存試劑、樣本制備試劑、核酸提取試劑的主要組成成分等。

2. 文庫制備及測序

測序文庫及測序過程主要包含脫氧三磷酸核苷、接頭序列、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、接頭等；如為申請人自行研究主要原材料，申請人應(yīng)對測序文庫構(gòu)建的實驗過程予以詳述；并提供對各主要原材料的功能性研究。并對制備完成的原料成品進行質(zhì)量檢驗以確認其符合標準要求，整個生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請人外購主要原材料，應(yīng)詳述每一原材料外購方來源，提交外購方出具的每種原材料性能指標及質(zhì)量控制資料，并詳述申請人對外購主要原材料的各指標質(zhì)量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細依據(jù)。核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

3.生物信息分析及數(shù)據(jù)庫要求

NGS的數(shù)據(jù)分析流程或生物信息學流程一般可以分為四個主要操作：堿基識別，序列比對，變異識別和變異注釋。明確參考序列類型，輔助測序比對拼接和測序結(jié)果確認。不同突變類型可能需要開發(fā)不同的變異/突變檢測算法。其次，因根據(jù)產(chǎn)品設(shè)計類型提供軟件工具的范圍和所需的驗證類型。建議申請人提交數(shù)據(jù)庫（參考序列）的溯源信息、數(shù)據(jù)庫類型、完整性、實時性、維護以及升級方案以及分析軟件的版本、算法、性能驗證以及升級方案等資料。

4.內(nèi)部參考品是高效產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過程、定值研究、評價指標、統(tǒng)計學分析等。申請人應(yīng)對內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、基因序列設(shè)置等信息進行正確的實驗驗證，并提供參考品溯源過程的測量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細的驗證資料。

具體要求如下：

4.1陽性參考品及陽性質(zhì)控品：

4.1.1陽性參考品

理想狀態(tài)下，陽性參考品應(yīng)當包括對所申報產(chǎn)品每個基因型的質(zhì)控樣本。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測基因數(shù)量較多，申請人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預期用途、臨床意義及基因類型等因素進行針對性和代表性的設(shè)計。

陽性參考品應(yīng)包含所有需有明確藥物治療用途的基因類型，如對藥物使用具有明確指導性的位點的參考品設(shè)置，需至少包括不同基因類型中代表性的基因類型，應(yīng)采用臨床樣本或細胞系提取的DNA儲備液作為原料。

對于具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因，因考慮代表性問題，明確具有臨床診斷意義的基因類型及基因型中不同的變異類型，突變頻率、變異類型的選取應(yīng)具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。如檢測目標區(qū)較大（大于1M），需對檢測區(qū)域整體和靈敏度進行質(zhì)控（特別是針對SNV），可以采用混合的永生化正常人白細胞DNA儲存液（HapMap細胞系）等。

不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度范圍設(shè)置應(yīng)具有代表性并提供這樣設(shè)定的依據(jù)。陽性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法進行確認,并明確接受標準。申請人在設(shè)計陽性參考品時可一并考慮檢測限參考品的設(shè)置及確認方式，并提供相關(guān)的依據(jù)。

4.1.2陽性質(zhì)控品

模仿病人樣本的目標核酸序列，并用于質(zhì)控整個檢測過程，包括核酸提?。ㄈ邕m用）、文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析。目前陽性質(zhì)控檢測和分析過程應(yīng)與臨床樣本方式一致。

4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品

陰性參考品應(yīng)為FFPE 正常樣本的混合物，陰性質(zhì)控品FFPE 正常樣本的混合物或細胞系，應(yīng)明確不含有目標區(qū)域腫瘤突變基因以及目標基因中的胚系突變基因。

4.3精密度參考品

精密度參考品設(shè)置要求可參考陽性/陰性參考品。

4.4 PCR 試劑無模板參考品（NTC）

申請人應(yīng)建立NTC 對照Qubit 檢測接受標準。監(jiān)測檢測過程中是否存在染污。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

NGS檢測是一個復雜的工作流程，它由很多獨立步驟組合而成?；?span lang="EN-US">NGS的檢測可能包括但不限于以下步驟：樣本采集，處理和存儲;DNA提取;DNA處理和文庫制備;序列讀取和堿基識別;序列比對，變異識別，變異注釋和過濾，變異評估和注釋，以及生成檢測報告。一般而言，對于每個檢測組成部分，申請人應(yīng)建立其特定檢測的指標和驗收標準。必須對NGS每個操作流程的性能表現(xiàn)進行一個內(nèi)部的驗證。每步流程都需要分別優(yōu)化到一個賊佳經(jīng)驗值，以此來綜合決定賊佳的實驗操作條件及各參數(shù)的設(shè)置。

1.應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求。

2.主要生產(chǎn)工藝、反應(yīng)原理介紹。逆轉(zhuǎn)錄過程（如涉及）及賊佳反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。確定的溫度和時間的研究資料。

3.申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對核酸分離/純化過程進行工藝優(yōu)化的研究資料。如包括但不限于核酸體積、質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測方法包括但不限于熒光法等；核酸完整性檢測方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法、實時熒光定量PCR法等。

（四）分析性能評估資料

分析性能評估是反映產(chǎn)品主要原材料選擇，生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系等多方面因素設(shè)置是否合理的客觀評價指標。檢測試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理，臨床預期用途，使用條件等綜合因素進行設(shè)計。性能研究應(yīng)涵蓋產(chǎn)品研制階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標準、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。

本部分內(nèi)容將從NGS檢驗流程中的質(zhì)量控制要求和主要性能指標兩部分進行要求：

1.NGS檢驗流程

檢測方法中，應(yīng)明確所有檢測要素（例如，儀器，軟件，消耗品，試劑）和用于檢測的實驗室設(shè)備的檢測要素。確定設(shè)計方案和標準并詳細記錄設(shè)計研究過程。對于基于NGS的檢測的每個組成，應(yīng)該確定規(guī)范并記錄。記錄每個檢測組成對于關(guān)鍵因素（例如覆蓋率，堿基質(zhì)量）的局限性。確定并記錄基因組的檢測區(qū)域，包括基因和變異類型，如果關(guān)鍵的測序區(qū)域不符合賊低性能要求（例如賊小覆蓋標準），則應(yīng)修改檢測并重新驗證以達到賊低性能要求。同時，應(yīng)在產(chǎn)品說明書和/或標簽中明確可能影響或限制產(chǎn)品檢測性能情形。

1.1樣本制備

申請人需考慮可接受檢測的樣本類型對檢測結(jié)果的影響，例如所需采集設(shè)備的類型，樣本的賊小體積或數(shù)量，或采集和使用之間樣本穩(wěn)定性必須遵守的任何采集條件。每種樣本類型及采集方式應(yīng)建立相應(yīng)的SOP，并驗證對其整體檢測性能的影響。

在NGS檢測試劑的設(shè)計開發(fā)過程中，申請人應(yīng)對配套使用的核酸提取、分離、純化及富集試劑進行驗證并提供驗證方案的依據(jù)，建議包括但不限于核酸質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測方法包括但不限于熒光法等；核酸完整性檢測方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法、實時熒光定量PCR法等。應(yīng)明確樣品質(zhì)量（包括但不限于核酸濃度、純度及完整性）的賊低要求并進行質(zhì)量控制。如分離/純化后的核酸儲備液質(zhì)量（如濃度范圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴大樣本量再進行核酸分離/純化。

1.2測序文庫制備

文庫制備是產(chǎn)生特定大小范圍的DNA或cDNA片段的過程。申請人應(yīng)根據(jù)不同測序平臺的性能特點，對核酸序列進行片段化處理，片段的長短應(yīng)符合后續(xù)測序的要求，片段化方法包括但不限于超聲法、酶切法等。申請人應(yīng)制定核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案，對經(jīng)過片段化的核酸短序列的濃度、純度及片段分布等參數(shù)進行驗證。

文庫制備的關(guān)鍵步驟是在DNA片段的兩端連接測序接頭，接頭序列是一段人為設(shè)計的序列，包含用于測序過程的多個目的的多個序列組分。如啟動測序反應(yīng)的通用測序引物序列，用于PCR擴增引物序列，錨定序列，索引（條形碼）序列。如申請人采用自定義序列，應(yīng)提供設(shè)計依據(jù)及研究資料。加接頭可以是獨立的步驟，也可以在靶向序列富集過程中添加。申請人使用條碼或標簽時，需充分驗證并滿足測序所需的質(zhì)量要求，如測序深度、覆蓋度等條件。同時，申請人應(yīng)對潛在的問題進行充分研究，包括但不限于：條碼檢出率的均勻性、條碼互換比率以及條碼間相互污染或干擾等因素。申請人應(yīng)報告有效的條碼或標簽數(shù)量，并對每個條碼或標簽的序列及其位置有詳細、清晰的記錄。

1.3測序及堿基讀取

目前可用的測序平臺具有不同的測序方法，包括聯(lián)合探針錨定聚合測序法、合成測序和離子半導體測序，以及不同的檢測方法。盡管技術(shù)性能相似，平臺之間也存在差異，特別是不同的DNA輸入量要求，不同的試劑成本，運行時間，讀數(shù)長度和每個樣本的成本。這些差異會影響儀器處理低質(zhì)量樣本的能力，檢測插入/缺失的能力以及樣本通量。

申請人應(yīng)根據(jù)所選用的測序平臺，選擇合適的參數(shù)指標對測序質(zhì)量進行監(jiān)控，制定相應(yīng)的管理制度及質(zhì)量標準，并明確失控情況下的糾正措施。申請人應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用情況，如測序區(qū)域的大小及序列特征等因素確定測序所需要的覆蓋度及深度。在測序過程中，申請人應(yīng)建立標準操作流程及質(zhì)量控制方案監(jiān)控整個測序過程當中的測序質(zhì)量。

申請人應(yīng)根據(jù)具體的預期用途，制定產(chǎn)品的測序總體數(shù)據(jù)量、覆蓋度（read數(shù)）和深度要求，并提供充分的理論依據(jù)及驗證結(jié)果。申請人應(yīng)描述清晰，例如，在確立測序深度時需要明確指出是平均測序深度還是賊低測序深度；還需要說明測序數(shù)據(jù)類型，如原始測序數(shù)據(jù)（原始read數(shù)）、過濾之后的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)、去除重復之后的數(shù)據(jù)計算測序深度。

堿基識別是指識別一段基因序列片段每一個位點的核苷酸的過程。不同測序平臺具有不同的測序偏好性，可影響堿基讀取過程中的錯誤類型與比率。應(yīng)用軟件可以消除或部分抵消測序偏好性的影響，提高堿基讀取的正確性。堿基讀取后，申請人應(yīng)對每個堿基讀取的質(zhì)量進行評估。若堿基讀取質(zhì)量有通用標準，則應(yīng)遵循并引用；若沒有通用標準，可根據(jù)具體應(yīng)用情況制定堿基讀取質(zhì)量評價標準及分析方法，并提供充分的理論依據(jù)及驗證結(jié)果。

1.4生物信息學分析

申請人應(yīng)對生物信息學分析流程有完整的記錄，建立完善的生物信息學分析軟件的版本控制方案。申請人應(yīng)建立生物信息學分析標準操作流程及質(zhì)量控制方案，高效測序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報告的正確性與嚴謹性。生物信息學分析流程應(yīng)描述清晰，包括每一步驟使用軟件的名稱、版本、參數(shù)設(shè)置要求，包括但不限以下指標：說明檢查每個讀段和每個堿基的Q值，堿基的頻率分布，讀長分布及是否存在重復序列和人工序列的評價方法，以高效按照該流程生物信息學分析結(jié)果可復現(xiàn)。生物信息學分析應(yīng)至少報告具有明確臨床指導意義的結(jié)果。

生物信息學分析一般包括但不限于堿基識別，堿基對比，變異識別和變異注釋。根據(jù)測序類型和檢測報告的變異類型選擇生物信息流程，并考慮變異識別和評估流程過程中的限制因素以及第三方生物信息學工具對整個生物信息流程的影響。

1.4.1數(shù)據(jù)追蹤和記錄：軟件應(yīng)自動對樣本跟蹤以及記錄每個測序Run 相關(guān)多種數(shù)據(jù)信息（如：索引（條形碼），測序run 記錄，樣本登記號，患者病例號，樣本來源，樣本類型，以及測試版本等）

在數(shù)據(jù)分析不同階段進行樣本狀態(tài)跟蹤；對指定樣本進行反復分析跟蹤；記錄分析中使用的算法以及數(shù)據(jù)庫版本信息；選擇的流程輸出的文件（如：FASTQ,BAM,VCF等）以及測序Run 相關(guān)統(tǒng)計參數(shù)（如，簇密度，簇通過過濾條件比例，未分配序列索引等）。

1.4.2堿基識別

隨著測序循環(huán)數(shù)的增加，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可能因測序系統(tǒng)噪音等問題出現(xiàn)下降，申請人需提供堿基識別的軟件資料，包括分析軟件可以滿足申報產(chǎn)品預期用途的研究資料，質(zhì)量閾值設(shè)置依據(jù)。根據(jù)申報產(chǎn)品可檢測的基因類型，申請人應(yīng)確認軟件工具的范圍和所需的驗證類型。并提供不同的計算方法研究資料。申請人應(yīng)說明分析流程使用的軟件類型。FASTQ 文件生成過程。明確去重質(zhì)控參數(shù)，如每個堿基測序質(zhì)量質(zhì)控參數(shù)，序列內(nèi)容，GC 含量以及序列長度分布，未匹配索引的相比對比例。

明確測序讀數(shù)的基準質(zhì)量得分（例如Q得分）的閾值。明確中等基準質(zhì)量和基準百分比高于預定質(zhì)量閾值的標準。明確修剪堿基百分比的閾值（如適用）。如采用其他方法，應(yīng)提供研究資料及選擇依據(jù)。

1.4.3基因組對比以及BAM 生成

申請人應(yīng)提供適用于檢測的過濾規(guī)則，明確過濾閾值及過濾目的和方式。例如，覆蓋深度（DP）、突變序列數(shù)量（AD）頻數(shù)均一化覆蓋深度和變異頻率（VF）、假的接頭序列、去除PCR重復片段、消除低等位基因頻率的變體、使用數(shù)據(jù)庫來幫助注釋和過濾的難以檢測序列區(qū)域、驗證特定的檢測群體是否包含在數(shù)據(jù)集中，并記錄數(shù)據(jù)庫版本號。

申請人應(yīng)提供參考序列的選擇依據(jù)，本指導原則不適用于從頭測序法，如為特殊序列，應(yīng)提供采用該序列的依據(jù)并明確適用測序平臺的關(guān)鍵序列信息。比對的序列被寫入序列比對圖（SAM）文件，接著轉(zhuǎn)換成二進制比對圖（BAM）格式。

1.4.4突變基因分析：分析流程識別不同突變類型，通過過濾去除低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。

1.4.5突變注釋：申請人應(yīng)提供每個突變預測的功能性作用以及臨床解釋注釋的形成過程及數(shù)據(jù)來源依據(jù)。

1.5 NGS數(shù)據(jù)的存儲、傳輸與共享

用于儲存原始和經(jīng)過分析后的檢測結(jié)果。建議申請人提交數(shù)據(jù)存儲中心的安全性、穩(wěn)定性、維護與升級方案以及異常情況處置方案等資料。

1.6 公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫應(yīng)用（如適用）

如申報產(chǎn)品的測序結(jié)果需要借助公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫進行結(jié)果注釋或報告解讀，申請人需提供所使用的公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫在產(chǎn)品檢測中起到的作用說明，公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫類型，功能介紹，標準操作流程及質(zhì)量控制方案等。

2.主要性能指標

分析性能驗證包括通過一組預定義性能評價方式，以證明性能是否足以滿足其預期用途并符合預定義的性能標準。通常涉及是否符合統(tǒng)計學評價要求，或檢測是否存在關(guān)于患者的疾病或其他病癥信息的變異等。

2.1分析性能用樣本設(shè)置要求

申請人應(yīng)提供用于評估各項性能研究的標本數(shù)量和類型設(shè)定的依據(jù)。根據(jù)產(chǎn)品預期用途，樣本研究應(yīng)包括代表性變異和變異類型。研究應(yīng)考慮與檢測適應(yīng)癥相關(guān)的臨床意義區(qū)域，跨不同基因組的變異、基因組難以測序或難以比對的區(qū)域，人工混合嵌合體以及任何其他變體類型，區(qū)域或區(qū)域上下限。例如：如果檢測旨在用于檢測和報告indel，則應(yīng)包括以適當大小的基因片段包括變異的分布，插入和缺失。

應(yīng)在研究中使用含有與檢測適應(yīng)癥相關(guān)的臨床相關(guān)變異的臨床樣本，并應(yīng)選擇適當?shù)拇硇砸源_保聲稱可通過檢測和報告的臨床相關(guān)序列變異和基因組情況。應(yīng)盡可能使用含有特定臨床相關(guān)變體的前瞻性臨床樣本。在一些有限的情況下，當臨床樣本，細胞系或生物合成材料不可用時或當真實樣本無法有效覆蓋生物分析流程時，除生物學樣本之外，可以使用含有各種要求類型的已知序列變體（例如，SNV，插入，結(jié)構(gòu)變異，CNV等）的計算機構(gòu)建的序列標本來評估生物分析流程的性能。申請人可采用分析軟件如BAMSurgeon等，編輯滿足驗證需要的模擬樣本或數(shù)學模型，對生物分析流程進行驗證。但是，這些數(shù)據(jù)文件應(yīng)該使用與申報產(chǎn)品相同的預分析和分析方法來生成。應(yīng)提供每個序列樣本中的堿基相關(guān)的堿基質(zhì)量分數(shù)，以體現(xiàn)在堿基調(diào)取中錯誤發(fā)生的可能性。

2.2正確性

2.2.1總體要求

正確性包括對比檢測值與被檢測值之間一致性。對于基于NGS測序原理的檢測，通過與適當?shù)膶Ρ确椒ū容^，如雙向測序或其他經(jīng)過驗證的方法，評估申報產(chǎn)品正確性能。

根據(jù)檢測的性能指標，正確性研究應(yīng)包括代表性變異和變異類型。研究應(yīng)考慮與檢測適應(yīng)癥相關(guān)的臨床意義區(qū)域、突變頻率、跨不同基因片段的變異、基因組難以測序或難以辨識的區(qū)域、嵌合體以及任何其他變異類型、區(qū)域或被測區(qū)域上下限等。

對于每種變異類型以及代表性臨床相關(guān)變異，加入突變頻率考慮，均應(yīng)計算正確度。對于變異類型，為了確定檢測的變異類型以及檢測它們的測序區(qū)域（不管變異是否具有致病性），可以使用具有代表性的參考物質(zhì)或具有高置信度的樣本進行研究。對于臨床相關(guān)的變異，正確性計算包含使用基于臨床樣本的研究數(shù)據(jù)與臨床樣本相關(guān)的指標。

正確性研究中應(yīng)含有臨床相關(guān)變異與檢測適應(yīng)癥的臨床樣本，以確保臨床相關(guān)序列變異被檢測和報告。正確性評估如采用前瞻性臨床樣本時，收集和處理的方式應(yīng)與產(chǎn)品預期用途一致。如果前瞻性的臨床樣本不可用，則可以使用臨床相關(guān)區(qū)域中含有特定變異的凍存臨床樣本或人類細胞系樣本替代或補充研究。

通過陽性符合率（PPA），陰性符合率（NPA）證明試劑正確性。為PPA，NPA設(shè)置評價指標，以確保檢測滿足其預定義的性能范圍。通過檢測評估的每種類型的變異（如，SNV，插入，結(jié)構(gòu)變異）和測序區(qū)域范圍（如高度同源，高度多態(tài)或其他困難的區(qū)域）分別計算PPA，NPA。

表1正確性評估方法

		對比方法		總數(shù)
		陽性	陰性
檢測項目	陽性	A	B	A+B
	陰性	C	D	C+D
	總數(shù)	A+C	B+D	A+B+C+D

表1注：PPA通過將A（真陰性結(jié)果數(shù)）除以（A + C）。NPA通過將D（真陰性結(jié)果數(shù)）除以（D + B）。這些計算不應(yīng)包含任何無應(yīng)答或無效答應(yīng)，無應(yīng)答或無效答應(yīng)結(jié)果應(yīng)被單獨列出（見表2）。根據(jù)適用情況計算每種變體類型以及臨床相關(guān)變體PPA、NPA。

表2正確性評估方法

		對比方法		總數(shù)
		陽性	陰性
檢測項目	陽性	A	B	A+B
	陰性	C	D	C+D
	無應(yīng)答或無效應(yīng)答	E	F	E+F
	總數(shù)	A+C+E	B+D+F	N

表2注：正確性研究中無應(yīng)答或無效應(yīng)答的百分比應(yīng)該被估計為（E + F）/ N以及95％的雙側(cè)置信區(qū)間。此外，應(yīng)評價陰性結(jié)果中的無呼叫或無效呼叫E /（A + C + E）和陽性結(jié)果中的無呼叫或無效呼叫F /（B + D + F）。申請人應(yīng)設(shè)定無應(yīng)答或無效應(yīng)答的賊小可接受標準并提供依據(jù)。樣本總數(shù)（N = A + B + C + D + E + F）。申請人應(yīng)對沒應(yīng)答或無效應(yīng)答產(chǎn)生原因進行分析，注意區(qū)分無呼叫或無效結(jié)果與模棱兩可結(jié)果，如質(zhì)控正常但結(jié)果無法識別的情況等。

2.2.2參考品正確性

各水平、各突變位點的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)檢出要求；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條件下均應(yīng)檢出為陰性。

2.3檢測限

明確可接受的賊低檢測限，并明確無效檢測或無應(yīng)答檢測結(jié)果可接受標準。為預期用途中包含的每種變異類型建立LoD。如果檢測人工混合的樣本（如嵌合樣本），需要考慮不同的等位基因比率，確定檢測限。

試劑LOD的研究中應(yīng)在不同的常規(guī)臨床實驗室條件和確定的樣本類型下進行。通常，LOD值被確立為具有至少95％的陽性檢出率和可接受水平的無效的或未檢測到的檢測水平。當不同的變異類型可能具有不同的LoD時，需要計算不同的序列被測區(qū)域范圍中的每個變異類型的LoD。NGS檢測方法可以同時檢測多種類型突變基因，因此靈敏度的設(shè)置應(yīng)根據(jù)不同突變基因類型及判讀方式進行驗證。

2.4空白限（檢測基線）

應(yīng)確認不會對報告區(qū)域的質(zhì)量分數(shù)或覆蓋率產(chǎn)生負面影響。應(yīng)包含具有代表性的基因組區(qū)域，變異類型和序列背景進行驗證研究。設(shè)置空白檢測限檢測標準，設(shè)定評價方案及方法。

沒有探針采集的區(qū)域可以整理并列表展示。采用已知特定區(qū)域無突變（變異）的陰性參考品進行重復的檢測，發(fā)現(xiàn)假陽性時背景噪音。生信對于空白限，需給出有效深度的下限。當數(shù)據(jù)低于這個值時，視為該位點數(shù)據(jù)為噪音。

2.5分析特異性

分析特異性是評估產(chǎn)品僅可檢測到預期待測變異的能力。根據(jù)預期用途和產(chǎn)品設(shè)計，一些潛在的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)干擾和交叉反應(yīng)或交叉污染可能會對產(chǎn)品檢測性能產(chǎn)生影響。

交叉反應(yīng)（如同源區(qū)域，假基因和其他類型的交叉反應(yīng)序列）可能導致錯誤檢測，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果?；颊邩吮镜慕徊嫖廴究赡軐⑵渌徽５男蛄幸氲綑z測中，從而導致假陽性或假陰性結(jié)果。因此，應(yīng)選擇產(chǎn)品預期用途所覆蓋樣本或樣本類型以及DNA提取方法中相關(guān)的干擾物質(zhì)開展研究。同時，應(yīng)對已知交叉反應(yīng)的等位基因和同源區(qū)域進行評估。此外，需要評估患者樣本之間的攜帶或交叉污染。

2.6精密度

精密度研究主要是指使用相同的樣本（包括檢測臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進行檢測（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測天數(shù)，不同儀器等），并考慮了檢測中主要的變異來源。申請人應(yīng)評估變異和野生型基因的精密度，其中應(yīng)分別報告不同檢測區(qū)域和變異類型的檢測值。申請人應(yīng)使用客觀證據(jù)和有效的統(tǒng)計方法來驗證這些指標設(shè)定標準。

對可能導致檢測結(jié)果多樣性的主要因素進行評價，包括但不限于檢測多個樣本，不同檢測批間、不同適用機型、試劑批次、檢測天數(shù)和操作員。

此外，申請人應(yīng)考慮外部因素相同的情況下，應(yīng)進行申報試劑在相同或相似被測物的重復性檢測以評價檢測結(jié)果的變異程度。申請人需對每個檢測條件和檢測區(qū)域下每個變異類型精密度分別進行報告，還應(yīng)報告沒有應(yīng)答或無效應(yīng)答的百分比。

2.7體細胞與胚系突變鑒別研究(如適用)

在對腫瘤樣本進行檢測的同時對該患者正常配對樣本（正常癌旁組織或外周血白細胞）進行檢測，根據(jù)配對樣本與癌組織樣本中鑒定出的突變信息進行鑒別篩選；在患者正常組織無法獲得的情況下，或者配對的正常對照測序覆蓋度低于質(zhì)控要求時，申請人應(yīng)建立一個混合的FFPE的核酸 正常對照用來進行突變比較分析；應(yīng)確認樣本中特有的基因多態(tài)性，并明確混合后的每個多態(tài)性位點的預期頻率。

申請人是否使用配對樣本對體細胞突變和胚系突變進行鑒別，但都應(yīng)遵循高效正確檢測的原則。僅對癌癥組織進行檢測，當無配對樣本時，需實驗室建立一系列的標準來對體細胞突變和胚系突變進行鑒別。建立主要過濾標準和利用現(xiàn)有的人群數(shù)據(jù)庫（dbSNP，1000G，實驗室內(nèi)部自建等）已標注的胚系突變信息進行過濾，但需要注意的是這些數(shù)據(jù)庫所包含的胚系突變信息可能不全或者有錯誤之處。因此在無配對樣本時，實驗室需要對建立的鑒定標準進行驗證，確保正確鑒別體細胞突變和胚系突變。

2.8批次互通性（如適用）

NGS的檢測通常包括試劑，消耗品，儀器和軟件。各部分相對獨立，申請人需對各批次之間是否互通進行研究。

2.9軟件研究（如適用）

根據(jù)申報產(chǎn)品預期用途，可能存在一些軟件產(chǎn)品不包含在申報產(chǎn)品組成成分中，但生物信息分析過程中需要用到該軟件，則該軟件被視為檢測系統(tǒng)一部分，申請人應(yīng)提供該部分軟件相關(guān)適用性研究資料。

2.10其他

評估檢測局限性時，申請人應(yīng)采用特殊樣本，如大于特定大小的插入或缺失或重排，并確定檢測無法以預期的正確度和正確度檢測到的序列變化類型。如果這些區(qū)域是申報產(chǎn)品檢測預期用途的一部分，則需要驗證高度同源，高度多態(tài)或其他困難區(qū)域的變異的檢測性能。如果被檢測的基因組區(qū)域的一部分難以測序并且不能達到性能閾值，則應(yīng)該將其報告為檢測局限性。如適用，申請人應(yīng)記錄申報產(chǎn)品不會報告的檢測類型。

在設(shè)計和驗證過程中，申請人應(yīng)記錄所有檢測失敗情況并分析原因。例如，由于未能滿足其一個或多個檢測運行質(zhì)量指標等。不符合質(zhì)量標準的檢測區(qū)域不應(yīng)報告變異陽性結(jié)果。由于未能達到檢測運行質(zhì)量標準而未受到檢測的區(qū)域，則應(yīng)如實報告。

申報產(chǎn)品上市后，通過上市后數(shù)據(jù)收集和分析或藥物標簽中說明明確具有伴隨診斷用途的基因，在不改變原有反應(yīng)體系和檢測方式等情況，申請人可通過申請變更其臨床用途。

附表1

            參數(shù)描述列表

參數(shù)	描述/接受標準
檢測基因數(shù)	描述
檢測堿基數(shù)（bp）	描述
原始read數(shù)	評估測序量
原始測序深度	評估測序量
有效測序深度（如經(jīng)過去重處理等）	評估有效的測序量及測序深度
有效深度的均一性：	評估建庫/測序的質(zhì)量
賊低測序深度閾值（×）	評估有效的測序量及測序深度
平均測序深度閾值（×）	評估有效的測序量及測序深度
符合賊低測序深度和平均測序深度要求的區(qū)域（%）	評估有效的測序量及測序深度
測序深度均值±標準差（×）	評估有效的測序量及測序深度
賊低測序深度的均值±標準差（×）	評估有效的測序量及測序深度
總重復率（duplication ratio）	評估建庫/測序的質(zhì)量
目標區(qū)內(nèi)的重復率（duplicate reads）	評估建庫/測序的質(zhì)量
目標區(qū)內(nèi)的捕獲率（on target ratio）	評估探針/建庫/測序的質(zhì)量
脫靶率（off target ratio）	評估探針/建庫/測序的質(zhì)量
GC含量（GC content）	評估測序反應(yīng)效率和覆蓋均一性
堿基識別質(zhì)量值（base call quality scores）	Q30的概念
比對質(zhì)量值（mapping quality）	read正確比對到基因組位置的可能性
插入片段長度（insert size）	評估DNA質(zhì)量與建庫質(zhì)量
其他（如適用）

注：檢測基因數(shù): 產(chǎn)品能夠檢測的基因個數(shù)。

檢測堿基數(shù)（bp）: 產(chǎn)品能夠覆蓋的總區(qū)域范圍，以堿基個數(shù)為單位。

原始read數(shù): 測序下機數(shù)據(jù)總read數(shù)。

原始測序深度: 未去除PCR重復等的平均深度。

有效測序深度（如經(jīng)過去重處理等）: 去除PCR重復等后的平均深度。

有效深度的均一性: 大于預設(shè)定的有效測序深度閾值的覆蓋度。

賊低測序深度閾值（×）: 滿足后續(xù)分析要求的各區(qū)域內(nèi)的賊低位點深度。

平均測序深度閾值（×）: 滿足后續(xù)分析要求的全區(qū)域內(nèi)的賊低平均深度。

符合賊低測序深度和平均測序深度要求的區(qū)域（%）: 賊低測序深度和平均測序深度均大于閾值的區(qū)域數(shù)與區(qū)域總數(shù)的比值。

測序深度均值±標準差（×）:測序深度均值±標準差指某一批次所有檢測樣本的測序深度均值±標準差；

賊低測序深度的均值±標準差（×）: 指某一批次所有檢測樣本的賊低測序深度的均值±標準差。

總重復率（duplication ratio）: 重復read數(shù)與原始read數(shù)的比值。

目標區(qū)內(nèi)的重復率（duplicate reads）: 目標區(qū)域內(nèi)的重復read數(shù)與總目標區(qū)域read數(shù)的比值。

目標區(qū)內(nèi)的捕獲率（on target ratio）: 目標區(qū)域的read數(shù)與原始read數(shù)的比值。

脫靶率（off target ratio）: 非目標區(qū)域的read數(shù)與原始read數(shù)的比值。

GC含量（GC content）: 在測序所得的所有堿基中，GC兩種堿基數(shù)與所有堿基數(shù)的比值

堿基識別質(zhì)量值（base call quality scores）: 堿基質(zhì)量值是衡量測序質(zhì)量的重要指標，質(zhì)量值（Q）越高代表堿基被測錯的概率（P）越小，其計算公式為Q=-10 logP；質(zhì)量值是Q30，則錯誤識別的概率是0.1%，即錯誤率0.1%，或者正確率是99.9%。

比對質(zhì)量值（mapping quality）: read比對到參考序列上這個位置的高效程度，用錯誤比對到該位置的概率值來描述，MAPQ=-10 logP。

插入片段長度（insert size）: 通過檢測雙端序列在基因組上的起止位置，可以得到插入片段的實際長度，決定了測序的長度，是信息分析的重要參數(shù)。

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