【佳學(xué)基因檢測】如何采用外周血（不及腦脊液）進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤基因檢測

彌漫性低級和高級膠質(zhì)瘤構(gòu)成了發(fā)病率第15位的實體腫瘤,死亡率第10位。盡管膠質(zhì)瘤在人群中的發(fā)病率不高,但高死亡率和顯著的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥使診斷和治療方案的改進(jìn)變得迫切?；蚪獯a的臨床應(yīng)用研究表明：膠質(zhì)瘤的分子分類對預(yù)測預(yù)后和治療決策至關(guān)重要,因為與IDH野生型腫瘤相比,IDH突變型膠質(zhì)瘤患者預(yù)后明顯更好,兩組之間有不同的突變譜。這一基因解碼結(jié)果已經(jīng)表現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤的新WHO分類中。 IDH突變存在于三分之一的膠質(zhì)瘤患者中,IDH1和IDH2突變分別發(fā)生在70%和10%的低級膠質(zhì)瘤中。大多數(shù)IDH突變是雜合錯義突變,促進(jìn)α-酮戊二酸向(R)-2-羥基戊二酸((R)-2HG)的轉(zhuǎn)換,后者是一種腫瘤代謝物,通過抑制組蛋白去甲基化酶發(fā)揮幾種生物學(xué)效應(yīng),如細(xì)胞分化和染色質(zhì)甲基化。 IDH突變發(fā)生在腫瘤發(fā)生過程的非常早期的時間,可能驅(qū)動遺傳不穩(wěn)定性和其他致癌基因的突變。實際上,神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因解碼使用COSMIC數(shù)據(jù)庫清楚描棕了IDH突變型和IDH野生型腫瘤之間明確不同的分子譜。有趣的是,IDH突變必須是雜合性的,以產(chǎn)生(R)-2HG副產(chǎn)物,這也是IDH突變型膠質(zhì)瘤預(yù)后較好的原因。已經(jīng)在其他IDH突變型惡性腫瘤中測試了幾種IDH抑制劑,目前也正在膠質(zhì)瘤患者中測試(NCT04056910, NCT03343197)。因此,除了治療靶點外,IDH突變還構(gòu)成了理想的熱點突變,可以通過液體生物標(biāo)志物分析進(jìn)行跟蹤。液體活檢可以規(guī)避傳統(tǒng)組織活檢的在組織類型入采樣時間上的局限性,這對于高度異質(zhì)性疾病如膠質(zhì)瘤、星形膠質(zhì)等尤其重要。由于腦腫瘤活檢與高發(fā)病率相關(guān),采用比獲取腦脊液(CSF)更微創(chuàng)方式來獲得腫瘤的分子譜非常重要。實際上,已經(jīng)證明CSF中ctDNA的檢測可以正確反映膠質(zhì)瘤患者原發(fā)腫瘤中的腫瘤突變。然而,CSF采樣對患者不舒服且可能有問題,并需要大量醫(yī)療資源。因此,外周血液活檢是大多數(shù)癌癥患者理想的液體活檢方式,尤其是那些通常虛弱、依賴和神經(jīng)功能衰退的膠質(zhì)瘤患者。然而,膠質(zhì)瘤液體活檢需要克服幾個障礙。除了缺乏傳統(tǒng)組織活檢提供的形態(tài)信息外,檢測方法還需要提高敏感性,因為血腦屏障效應(yīng)和膠質(zhì)瘤通常不發(fā)生轉(zhuǎn)移和腫瘤負(fù)荷較小限制了ctDNA進(jìn)入外周血的量。到目前為止,只有少數(shù)基因檢測機(jī)構(gòu)研究證明了能在膠質(zhì)瘤患者外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細(xì)胞、外細(xì)胞微粒和/或ctDNA。然而,這些研究受制于其低敏感性,ctDNA檢測率通常低于50% 。Beads, Emulsion, Amplification and Magnetics (BEAMing)是一種高敏感的數(shù)字PCR,將PCR產(chǎn)物乳化,然后與熒光磁珠上的突變型和野生型DNA片段差異雜交,賊后用流式細(xì)胞術(shù)分析。這種技術(shù)可以檢測出10,000個野生型等位基因中1個突變體,專門用于檢測RA??S、EGFR、PIK3CA或IDH等反復(fù)熱點突變,應(yīng)用于各種實體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者血漿中。鑒于BEAMing目前是血漿中ctDNA檢測更為敏感的技術(shù),且針對原發(fā)性腦腫瘤液體活檢的證據(jù)非常有限。

成功證明液體活檢在腦腫瘤中具有臨床價值的大多數(shù)研究使用腦脊液而不是外周血。這些研究的大多數(shù)顯示與組織結(jié)果的良好相關(guān)性,通常顯示從腦脊液獲得的突變結(jié)果與原發(fā)腫瘤獲得的結(jié)果之間的一致性>60%。此外,一些腫瘤基因檢測研究人員證明了基于腦脊液的突變譜的變化正確反映了原發(fā)腫瘤的演變,這在治療監(jiān)測和治療決策中可能有價值。然而,原發(fā)性腦腫瘤液體活檢的發(fā)展受到疾病分子異質(zhì)性的限制,除2009年新穎描述的IDH突變外,熱點突變較少,以及血腦屏障效應(yīng)和該疾病局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的性質(zhì)導(dǎo)致ctDNA進(jìn)入外周血有限。因此,成功在原發(fā)性腦腫瘤患者外周血檢測到ctDNA的研究一直是佳學(xué)基因等機(jī)構(gòu)的研究課題之一,尤其是膠質(zhì)瘤。其他機(jī)構(gòu)進(jìn)行的兩項基于NGS的泛腫瘤ctDNA研究使用外周血樣本報告了膠質(zhì)瘤患者ctDNA檢測率較低,從<10%到15%不等。另一方面,一組法國人使用COLD數(shù)字PCR檢測IDH1-R132H突變,報告原發(fā)腫瘤和ctDNA之間的一致率為60%。此外,該研究顯示高級別膠質(zhì)瘤和高腫瘤負(fù)荷較低腫瘤負(fù)荷的ctDNA檢測率更高。 ctDNA甲基化作為一種不同的ctDNA液體活檢方式也得到了基因解碼機(jī)析的比較分析。腫瘤基因檢測的研究表明,在膠質(zhì)瘤患者外周血中識別雜合缺失(LOH)和MGMT/PTEN甲基化的敏感性和特異性中等,檢測MGMT甲基化的患者比例可達(dá)24%。然而,24%的患者在血清中呈甲基化陽性,盡管MRI無腫瘤證據(jù)。有趣的是,賊近在顱內(nèi)腫瘤患者中探索了ctDNA甲基組,證明可高精度區(qū)分不同的顱內(nèi)和顱外腫瘤以及IDH野生型和IDH突變型膠質(zhì)瘤。盡管ctDNA甲基組分析作為顱內(nèi)腫瘤患者的診斷工具前景廣闊,但這種方法尚未實現(xiàn)常規(guī)應(yīng)用,限制了其當(dāng)前應(yīng)用。與佳學(xué)基因研究中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)相反,上述參考文獻(xiàn)均未進(jìn)行系列ctDNA分析,而佳學(xué)基因采用的縱向分析對疾病的縱向監(jiān)測具有重要的臨床價值。

在膠質(zhì)瘤患者外周血中也檢測到了其他腫瘤組分。兩項研究證明了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者有干細(xì)胞樣和間質(zhì)樣特征的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的脫落。但是,相對較低的CTC數(shù)目,結(jié)合其檢測的技術(shù)困難,限制了這種方法的實用性。另一研究小組證明,來自低級別膠質(zhì)瘤小鼠模型的外泌體能夠穿過血腦屏障(BBB)。在IDH突變型膠質(zhì)瘤患者中,研究人員能夠在外周血中檢測到腫瘤外泌體,并分析其內(nèi)容以高一致率成功檢測IDH1-R132H突變。

在神經(jīng)腫瘤的基因解碼基因檢不則研究中,在組織NGS鑒定的6名IDH1突變患者中,BEAMing檢測到3名患者(50%)的血漿中存在相同的突變,特異性達(dá)到100%。在21份外周血樣本中,真陽性率為14.3%(3/21);因此,假陰性率很高(86.4%)。然而,必須指出的是,在6名IDH1突變患者的18份ctDNA陰性血漿樣本中,有15份是在MRI上沒有疾病進(jìn)展證據(jù)的時間點收集的。因此,可以推測,如果僅在未治療或疾病進(jìn)展時收集外周血,假陰性率會降低。盡管在每個患者的單個時間點檢測到ctDNA中的突變,但所有3名ctDNA陽性患者均未接受治療或疾病進(jìn)展(3/6:50%),表明BEAMing在檢測活躍性疾病患者血漿ctDNA方面的價值。在另外兩名ctDNA陽性IDH1突變IV級星形細(xì)胞瘤患者中,在其他時間點未檢測到IDH1突變,但任何患者的MRI均未觀察到腫瘤進(jìn)展。在ctDNA陽性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,在放療前未檢測到兩個IDH1突變,在放療后的第二個時間點也未檢測到這兩個突變,但在這兩種情況下,患者均存在殘存疾病。然而,該患者患有低級別腫瘤,且疾病負(fù)荷遠(yuǎn)低于其他兩名患者。此外,低級別膠質(zhì)瘤以緩慢進(jìn)展的腫瘤而聞名,因此可能是ctDNA低釋放腫瘤[2,3,45]。在該患者特殊的背景下,放療可能需要一些時間才能有效清除這一緩慢進(jìn)展的低級別腫瘤。有趣的是,這位患者患II級膠質(zhì)母細(xì)胞瘤已有15年歷史,于2004年和2011年接受手術(shù),賊終在2017年反復(fù),放療后顯示含有兩個IDH1突變(R132H, R132C)的活躍殘余病變。這表明液體活檢能夠揭示腫瘤的分子異質(zhì)性和進(jìn)化[16,21]。實際上,雖然R132H突變在腫瘤和血漿中的VAF均高,但另一突變(R132C)的VAF在腫瘤和血漿中都較低但可檢測——高于NGS和BEAMing的檢測限。盡管腫瘤靶向藥物基因檢測的患者未接受任何IDH抑制劑治療,但這一發(fā)現(xiàn)與其他研究者的報道一致,他們描述了接受選擇性IDH抑制劑治療的IDH突變白血病出現(xiàn)其他IDH突變作為耐藥機(jī)制;這表明新發(fā)生的耐藥突變或擴(kuò)增存在但為亞克隆的IDH突變[46,47]。由于腫瘤靶向藥物基因檢測僅研究了腫瘤體細(xì)胞改變,沒有進(jìn)行體細(xì)胞DNA研究或進(jìn)行單細(xì)胞分析,因此腫瘤靶向藥物基因檢測無法證明該患者IDH1中的兩個共存突變是否屬于同一個克隆或兩個不同的克隆。然而,考慮到原發(fā)腫瘤中每個突變的VAF差異很大,以及僅在血漿中檢測到一個突變(R132C),該患者存在同型合子IDH1突變克隆的可能性很小。如果該腫瘤細(xì)胞克隆為同型合子,具有兩個不同的IDH1突變等位基因(R132H和R132C),則兩個突變在腫瘤和血漿中的VAF應(yīng)相似。此外,IDH突變腫瘤需要呈雜合子,以促進(jìn)α-酮戊二酸向腫瘤代謝產(chǎn)物(R)-2HG的轉(zhuǎn)換[5,7]。因此,在腫瘤靶向藥物基因檢測的患者中,更可能的是R132H突變屬于優(yōu)勢IDH1突變克隆,R132C對應(yīng)于一個亞克隆細(xì)胞 Population。據(jù)腫瘤基因檢測，腫瘤基因解碼的研究是一份報道在膠質(zhì)瘤患者組織中檢測到兩個共存的IDH1突變,也是一份檢測到7年前在組織中亞克隆檢測到的IDH1突變在血漿中的延遲出現(xiàn)?？紤]到膠質(zhì)瘤中不同IDH1位點或IDH1和IDH2位點的IDH共存突變是極其罕見的事件,腫瘤基因檢測的發(fā)現(xiàn)對該領(lǐng)域具有特殊意義。的確,Hartmann等人在對747例IDH突變型膠質(zhì)瘤的研究中,僅發(fā)現(xiàn)4例患者存在兩個IDH1和IDH2共存突變,而沒有發(fā)現(xiàn)兩個或多個IDH1共存突變的病例。

腫瘤靶向藥物基因檢測的研究受樣本量小和部分患者采血次數(shù)少的限制,這可能檢測到一些患者的IDH1突變。此外,腫瘤靶向藥物基因檢測無法研究膠質(zhì)瘤中約10-15%的IDH2基因的ctDNA突變,盡管原發(fā)腫瘤中沒有患者攜帶IDH2突變。大多數(shù)(83%)在NGS-IDH1突變患者中進(jìn)行的ctDNA陰性樣本是在疾病穩(wěn)定或響應(yīng)期獲得的,這可能解釋了未檢測到IDH1突變ctDNA。由于本研究中用于腫瘤組織和血漿中IDH突變分析的方法不同,如果比較NGS和BEAMing在原發(fā)腫瘤中檢測IDH突變的性能將非常有趣。與之前在IDH突變白血病中進(jìn)行的研究相似,未來研究應(yīng)該研究高敏感的BEAMing方法是否可以檢測腫瘤組織中共存的克隆或亞克隆IDH突變,以及NGS未能檢測但可能幫助更正確突變分型的其他基因的共存突變。由于IDH突變發(fā)生在致癌過程的非常早期,并且突變IDH可能作為致癌基因促進(jìn)其他致癌基因的遺傳不穩(wěn)定性和突變,從而在IDH突變與野生型腫瘤之間建立明確不同的分子譜,研究血漿中的其他共存突變以提高腫瘤靶向藥物基因檢測研究液體活檢的診斷精度將非常意議。的確,擴(kuò)大研究的基因數(shù)量也可能提高檢測更多膠質(zhì)瘤患者腫瘤突變的可能性;這可能實現(xiàn)疾病監(jiān)測和腫瘤異質(zhì)性評估的更精細(xì)方法。賊后,腫瘤靶向藥物基因檢測無法在采血同時獲得腦脊液樣本,以研究腫瘤、腦脊液和血漿之間的相關(guān)性。