【佳學基因檢測】唇裂基因檢測技術的進展與應用

唇裂（Cleft Lip）是一種常見的先天性顱面畸形，通常分為非綜合征性唇裂伴腭裂（NSCLP）和非綜合征性單純唇裂（NSCLO）。近年來，隨著基因檢測技術的發(fā)展，唇裂基因檢測技術更新團隊能夠更深入地唇裂致病基因鑒定基因解碼唇裂的遺傳背景，從而為疾病的早期診斷、預防和個體化治療提供新思路?！洞搅寻l(fā)生的原因查找與跟蹤》將介紹唇裂的基因檢測技術及其在唇裂致病基因鑒定基因解碼和臨床應用中的進展。

樣本收集與唇裂致病基因鑒定基因解碼背景

在唇裂基因檢測的唇裂致病基因鑒定基因解碼中，樣本的收集和分析是關鍵的第一步。唇裂基因檢測技術更新團隊在2017年至2019年期間招募了159例NSCL/P患者，其中包括79例NSCLP和80例NSCLO患者，這些患者均在四川大學華西口腔醫(yī)院接受手術治療。此外，還收集了542名未受影響的對照組數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來自于佳學基因致病基因鑒定基因解碼的全基因組測序（WGS）數(shù)據(jù)，覆蓋度為39.89×。在隨后的唇裂致病基因鑒定基因解碼中，唇裂基因檢測技術更新團隊又在2004名NSCL/P患者和1823名對照組中進行了一輪重要單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的復制唇裂致病基因鑒定基因解碼，并在1729名NSCL/P患者、995名非綜合征性腭裂（NSCPO）患者和996名健康對照中進行了第二輪復制唇裂致病基因鑒定基因解碼。所有參與者均為漢族人群。

為了確保唇裂致病基因鑒定基因解碼的倫理合規(guī)性，所有參與者或其監(jiān)護人均簽署了知情同意書。該唇裂致病基因鑒定基因解碼獲得了四川大學華西口腔醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會（WCHSIRB-D-2018-012R1）的批準，并遵循《流行病學觀察性唇裂致病基因鑒定基因解碼報告強化標準》（STROBE）指南。

目標區(qū)域的測序準備與實施

基因選擇與目標區(qū)域

唇裂致病基因鑒定基因解碼人員根據(jù)中國漢族（CHB）和日本（JPT）人群的HapMap連鎖不平衡（LD）結構，選擇了位于IRF6基因周圍的目標區(qū)域進行測序。具體選擇了位于染色體1的209,923,704至210,382,027（Hg19）區(qū)域，長度為458.323 kb，涵蓋了IRF6基因的編碼和非編碼區(qū)域。

測序文庫的制備

為了有效捕獲和富集目標區(qū)域的基因片段，唇裂致病基因鑒定基因解碼團隊使用了Agilent液相捕獲系統(tǒng)（Agilent SureSelectXT Custom Kit）。具體步驟如下：

1. 基因組DNA片段化：使用Covaris粉碎儀將1.0 μg基因組DNA樣本剪切成180至280 bp的片段。
2. 文庫構建：進行末端修復和A尾添加，然后將特異性索引接頭連接到片段兩端，以制備DNA文庫。
3. 目標區(qū)域捕獲：將DNA文庫與生物素標記的探針雜交，并通過含鏈霉素的磁珠捕獲目標區(qū)域。
4. PCR擴增與質量檢測：對捕獲區(qū)域進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，并進行文庫質量檢測。
5. 高通量測序：最終在Illumina Hiseq 4000平臺上進行雙端150 bp的測序。

基因分型與統(tǒng)計分析

基因分型技術

在復制唇裂致病基因鑒定基因解碼中，選擇的SNPs通過SNPscan方法進行基因分型，該方法基于雙連接和多重熒光PCR。為確保基因分型的準確性，隨機選擇了4%的樣本進行重復分析。

統(tǒng)計分析

使用PLINK軟件對SNP進行統(tǒng)計分析，包括哈迪-溫伯格平衡（HWE）檢驗、關聯(lián)分析、單體型關聯(lián)的滑動窗口分析和條件邏輯分析。唇裂基因檢測技術更新團隊從發(fā)現(xiàn)階段選擇了5個顯著的SNPs進行進一步復制唇裂致病基因鑒定基因解碼，選擇標準如下：

1. 最小次等位基因頻率：GnomAD_EAS_AF和1000基因組_EAS≥0.3。
2. 連鎖不平衡區(qū)塊：根據(jù)1000基因組數(shù)據(jù)庫中的CHS&CHB連鎖不平衡區(qū)塊，選擇標記SNPs以最大限度地覆蓋所有顯著的SNPs。

經(jīng)過Bonferroni多重校正，目標測序階段的關聯(lián)分析P值顯著性閾值為4.59E-05，第一輪復制Prep1為0.0033，第二輪復制Prep2和綜合P值Pcomb為0.0042。使用Haploview計算成對連鎖不平衡，同時根據(jù)以下公式計算人群歸因風險百分比（PAR%）：PAR% = [Pe (RR − 1) / RR] × 100（Pe為病例中等位基因的流行率，RR為相對風險；比值比OR用作RR的代理）。

定量實時PCR分析

在進行基因表達分析時，唇裂致病基因鑒定基因解碼人員收集了54名NSCLO和32名微型唇裂（MCL）患者的唇部組織樣本，這些樣本是在患者約1歲時進行唇裂修復手術時收集的。樣本總RNA使用RNA-easy Isolation Reagent（Vazyme）提取，并使用PrimeScript RT試劑盒和TB Green Fast qPCR混合物（Takara）進行反轉錄為cDNA和進一步的定量實時PCR（RT-qPCR）分析。最終，使用GAPDH作為參考基因，通過2–ΔΔCt方法分析IRF6的相對表達水平。

基因檢測的臨床應用與展望

基因檢測的應用

唇裂的基因檢測技術不僅在基礎唇裂致病基因鑒定基因解碼中具有重要意義，也在臨床應用中展現(xiàn)出巨大潛力：

• 早期診斷：通過基因檢測，可以在嬰兒出生前識別出唇裂的風險，為早期干預提供機會。
• 個體化治療：了解患者的基因變異有助于制定個性化治療方案，提高治療效果。
• 遺傳咨詢：基因檢測結果可為家族提供遺傳咨詢，幫助家族成員了解自身和后代患病風險。

唇裂致病基因鑒定基因解碼進一步提升計劃

盡管基因檢測在唇裂風險評估中顯示出巨大潛力，但仍面臨一些挑戰(zhàn)：

• 準確性和可靠性：基因檢測的準確性和可靠性需要在不同人群中進行驗證。
• 倫理和隱私問題：基因檢測涉及倫理和隱私問題，需要妥善處理。
• 跨學科合作：基因檢測的進展需要生物學、醫(yī)學和數(shù)據(jù)科學等多個學科的緊密合作。

總之，唇裂基因檢測技術的發(fā)展為疾病的早期診斷、預防和個體化治療提供了新的可能。隨著技術的不斷進步和唇裂致病基因鑒定基因解碼的深入，基因檢測將在唇裂的預防和治療中發(fā)揮更大作用。通過進一步的唇裂致病基因鑒定基因解碼和臨床應用，基因檢測將為患者和家庭帶來更多的益處。