【佳學(xué)基因檢測】如何對多發(fā)性骨髓瘤的基因序列變化進行基因檢測？

多發(fā)性骨髓瘤患者樣本和 FACS

作為臨床常規(guī)的一部分，在佳學(xué)基因合作醫(yī)院收集了多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓樣本?；颊卟牧系氖占褪褂眯璜@得所在醫(yī)院倫理審查機構(gòu)的批準，并根據(jù)赫爾辛基宣言進行。為了分析純化的細胞亞群，細胞使用 FACS ARIA IIu 分選儀 (BD Biosciences) 進行 FACS。在分選過程采用碘化丙啶 (PI) 排除死細胞。使用 CD319 補償冷凍保存材料上 CD138 的損失，接受 FACS 的多發(fā)性骨髓瘤細胞被分選為為 PI ^- CD14/CD16/CD11b ^- CD3 ^- CD319 ⁺ CD38 ⁺. 此外，CD138、CD19、CD45 和 CD56 用于根據(jù)表達定義多發(fā)性骨髓瘤細胞。接受 FACS 的粒細胞和 T 細胞的分選標準分別為 PI ^- CD14/CD16/CD11b ⁺ CD3 ^- CD19 ^- CD56 ^- CD319 ^- CD45 ⁺ CD38 ^-和 PI ^- CD14/CD16/CD11b ^- CD3 ⁺ CD19 ^- CD56 ^- CD319 ^- CD45 ⁺ CD38 ^-。

FISH基因檢測

使用針對 t(4;14)、t(14;16)、t(11; 14 )、 1q21、4p16、6q21、8p12、9p21、11q13、13q14、13q34、14q32 、 15q22、16q23、17p13 和 19q13的探針進行FISH基因檢測。

lrWGS

在制備測序文庫時，將 200 至 240 個經(jīng)過 FACS 處理的細胞分選到 8 μL 含 2% 胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水中；將管短暫脈沖旋轉(zhuǎn)，在干冰上冷凍，并儲存在-80°C直至使用。為了使細胞變性并使基因組 DNA 易于獲取，使用窄孔吸頭添加 2 μL 0.25N NaOH，并通過小心輕彈試管來混合樣品。在室溫下孵育 5 分鐘后，將 97.5 μL 樣品主混合物（89.5 μL 基因組試劑混合物、3 μL 添加劑 A 和 5 μL 基因組酶混合物；Chromium Genome Reagent Kit [v2 Chemistry]）添加到具有窄孔先進的變性細胞。隨后，使用大口徑吸頭輕輕移液混合樣品。將總共?? 90 μL 的樣品混合物（含有約 1.2 ng DNA）加載到 Chromium 基因組芯片上，其余步驟根據(jù)產(chǎn)品說明（手冊 CG00043 Rev B）執(zhí)行。使用 Qubit dsDNA HS 試劑盒（Invitrogen）對條形碼文庫進行量化，合并，并使用 Illumina 平臺（Novaseq；Illumina，San Diego，CA）進行配對末端測序（2×150 個循環(huán)）。

使用 Long Ranger 處理數(shù)據(jù)，輸出文件用于下游分析。簡而言之，染色體數(shù)是使用 BarCrawler ( https://github.com/J35P312/BarCrawler ) 結(jié)合內(nèi)部腳本計算的；對于選定樣本，還使用 ??CNVkit (v0.9.8)、 ASCAT (v2.5.2)、和 Battenberg 方法 (v2.2.9)評估了染色體數(shù)目；使用 FindSV ( https://github.com/J35P312/FindSV ) 和 Long Ranger 調(diào)用 CNV；體細胞變異調(diào)用是使用 nf-core/Sarek 分析方案（v2.6 ；使用 Strelka2 [v2.9.10] 和 Mutect2 [GATK v4.1.7.0] 作為獲得基因突變位置）和 VEP (v99.2) 和 SnpEff (v4.3t) 的組合用于變體注釋；使用 GROC-SV (v0.2.5) 結(jié)合 Long Ranger 識別 SV；并在Loupe和 IGV 中目視驗證SV。

RNA測序

鏈特異性 RNA 測序數(shù)據(jù)是從多發(fā)性骨髓瘤細胞生成的。使用 STAR (v2.5.2b) 將測序數(shù)據(jù)與hg38進行比對，使用 HOMER 量化外顯子中的46 個讀數(shù)，使用 R 計算每百萬轉(zhuǎn)錄本 (TPM)。

ChipSeq

使用 H3K27Ac 抗體（批次 A1723-0041D/2；目錄號 #C15410196；Diagenode）對 20000 個用于FACS的多發(fā)性骨髓瘤細胞進行染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIPseq）。但對對照的制備進行了微小修改。使用 bowtie2 將 Fastq 文件匹配到到hg38，并使用 HOMER、 DEseq2和 R 進行下游分析。

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