【佳學(xué)基因檢測】基因檢測關(guān)鍵問題：肺癌風(fēng)險是由什么遺傳的？

肺癌風(fēng)險基因檢測位點的發(fā)現(xiàn)與收集

肺癌首個全基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS) 發(fā)表 14 年后，目前已有約 45 個基因位點與肺癌風(fēng)險顯著相關(guān)?；蚪獯a基因檢測已對其中幾個基因位點進(jìn)行了功能表征，正在進(jìn)行對肺癌風(fēng)險分子理解的全面總結(jié)。此外，現(xiàn)在有許多新型計算和實驗工具可用來加速對疾病相關(guān)變異的功能評估，超越了逐個基因位點的方法。在《基因檢測關(guān)鍵問題：肺癌風(fēng)險是由什么遺傳的》中，肺癌風(fēng)險基因檢測首先強調(diào)了肺癌 GWAS 結(jié)果在組織學(xué)亞型、祖先和吸煙狀況之間的異質(zhì)性，這對后續(xù)研究提出了新穎的解碼解析方向。然后，肺癌風(fēng)險基因檢測總結(jié)了每個風(fēng)險相關(guān)基因位點的已發(fā)表肺癌 GWAS 后研究，以評估當(dāng)前對初始統(tǒng)計關(guān)聯(lián)以外的生物學(xué)機制的理解。肺癌風(fēng)險基因檢測進(jìn)一步總結(jié)了 GWAS 功能后續(xù)研究的策略，考慮了先進(jìn)功能基因組學(xué)工具，并提供了與肺癌相關(guān)的可用資源目錄?？偟膩碚f，肺癌風(fēng)險基因檢測旨在強調(diào)整合計算和實驗方法的重要性，以便從肺癌 GWAS 結(jié)果中得出超越關(guān)聯(lián)的生物學(xué)見解。
 

為什么要進(jìn)行肺癌風(fēng)險基因檢測？

肺癌是全球第二大常見癌癥，也是癌癥死亡的主要原因，占癌癥死亡總數(shù)的 18% 。利用功能基因組學(xué)工具和資源的更新進(jìn)展，GWAS 后策略正在開始向多基因座方法過渡。肺癌基因檢測位點豐富工作小組肺癌風(fēng)險基因檢測總結(jié)了肺癌 GWAS 結(jié)果的顯著異質(zhì)性，討論了已發(fā)表的肺癌 GWAS 后功能研究，并提供了與肺癌 GWAS 功能表征相關(guān)的可用功能基因組學(xué)工具和策略。

肺癌 GWAS 結(jié)果的異質(zhì)性

組織學(xué)亞型

肺癌有兩種主要組織學(xué)亞型——非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 和小細(xì)胞肺癌 (SCLC) 。根據(jù) GWAS 目錄（訪問日期：2021 年 7 月 15 日，通過術(shù)語“肺癌”搜索，并以全基因組顯著性P  ≤ 5 × 10 −8進(jìn)行過濾。這些結(jié)果共同表明，導(dǎo)致 SCLC、LUAD 和 SQC 風(fēng)險的遺傳因素不同，可能表明潛在的機制不同。

祖先

盡管大部分 GWAS 是在歐洲人群中進(jìn)行的，但在亞洲人群中也有了重大發(fā)現(xiàn)。根據(jù) GWAS 目錄，相當(dāng)一部分基因座（46 個中的 25 個）僅在歐洲（17 個基因座）或東亞（8 個基因座）人群中顯著，44%（41 個基因座中的 18 個）的已鑒定基因座在所有三個祖先中均表現(xiàn)出顯著性。祖先特異性位點要在歐洲人中觀察到，可能是由于樣本量不平衡造成的，但也觀察到了 EAS 或 AFR（非洲）特異性信號，包括罕見變異的位點。

值得注意的是，非歐洲/東亞人群（例如非洲人）的肺癌 GWAS 仍然很少見。在 5339 名非裔美國人的 GWAS 中，最初在歐洲和亞洲人群中發(fā)現(xiàn)的兩個已知基因座（15q25.1 和 5p15.33）達(dá)到了全基因組顯著性，但沒有發(fā)現(xiàn)新的基因座。值得注意的是，迄今為止，西班牙裔/拉丁裔人群中尚未報告 GWAS。需要在代表性不足的人群中開展更大樣本量的進(jìn)一步研究，以剖析不同祖先之間的異質(zhì)性。

吸煙狀況

全球約 25% 的肺癌患者為終生不吸煙者。這些觀察結(jié)果表明，從不吸煙者的肺癌在病因和致癌途徑方面呈現(xiàn)出不同的特點。

已開展了多項針對非吸煙者肺癌的 GWAS 研究。肺癌基因解碼基因檢測及其同事對非吸煙亞洲女性（5510 例病例和 4544 例對照）進(jìn)行了 GWAS 研究，結(jié)果證實了主要針對吸煙者的研究中所報告的位點（5p15、3q28 和 17q24.3），并確定了新的位點（10q25.2、6q22.1 和 6p21.32）。

盡管在確定從不吸煙者肺癌相關(guān)獨特基因位點方面做出了這些努力，但利用目前的樣本量很難區(qū)分祖先、性別和主要組織學(xué)等其他因素與吸煙的影響。

肺癌風(fēng)險基因位點的 GWA 后研究

除了初始 GWAS 的顯著關(guān)聯(lián)外，統(tǒng)計精細(xì)定位（識別獨立信號并在具有相似P值的多個變體中優(yōu)先考慮最合理的變體）和功能分析為幾種肺癌相關(guān)基因座的生物學(xué)意義提供了線索。這些基因座可能與吸煙行為和尼古丁代謝、端粒生物學(xué)、免疫反應(yīng)、DNA 損傷反應(yīng)和修復(fù)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等途徑有關(guān)。值得注意的是，對于許多這些基因座，仍需要建立 GWAS 信號、功能變體和靶基因之間的牢固聯(lián)系，以全面了解生物學(xué)機制。

吸煙行為和尼古丁代謝

15q25.1

不管是中國人，還是歐洲人，均沒有跡象表明15q25.1 基因在從不吸煙的人群中與肺癌的發(fā)生有關(guān)。

該基因座包括三個煙堿乙酰膽堿受體 (nAChR) 亞基基因 (CHRNA5、CHRNA3 和 CHRNB4)，這些基因上或附近的變異也與吸煙狀況和尼古丁成癮  有關(guān)。盡管這些變異在歐洲人中處于高 LD，但對非裔美國人的精細(xì)定位將關(guān)聯(lián)信號細(xì)化到 CHRNA5 上或附近的變異，包括錯義變異 rs16969968 (D398N，與 rs55781567 的 R2 = 0.9089；圖 1A) 。在人類胚胎腎（HEK293）細(xì)胞中的實驗數(shù)據(jù)表明，與吸煙行為相關(guān)的 A 等位基因（398N）在高外部鈣存在的情況下降低 nAChR 對激動劑（如乙酰膽堿和尼古丁）的反應(yīng)，這可能導(dǎo)致不同的下游細(xì)胞信號傳導(dǎo)（圖 1B）。一項 fMRI 研究表明，在 D398N 替換的個體中，前扣帶皮層與腹側(cè)紋狀體回路的連接性降低與吸煙和成癮嚴(yán)重程度有關(guān)。在小鼠中，D398N 替換將導(dǎo)致 nAChR 功能部分喪失，同時尼古丁攝入量增加。rs16969968 和其他變體是歐洲人群腫瘤鄰近正常肺組織中 CHRNA5 水平的表達(dá)數(shù)量性狀位點（eQTL），這在另外兩個肺組織數(shù)據(jù)集中得到了復(fù)制。除了單個變異的 GWAS 和 eQTL P 值的簡單重疊之外，使用 GTEx 肺組織的轉(zhuǎn)錄組全關(guān)聯(lián)研究 (TWAS) 正式發(fā)現(xiàn)基于多個局部變異基因型推斷的 CHRNA5 表達(dá)水平與肺癌風(fēng)險之間存在顯著關(guān)聯(lián)  (圖 1A)。這些 SNP 的肺癌風(fēng)險相關(guān)等位基因與較低的 CHRNA5 水平相關(guān)。
 

圖1：15q25.1 肺癌 GWAS 基因座功能性發(fā)現(xiàn)總結(jié)。（A）圍繞基因IREB2、PSMA4、CHRNA5和CHRNA3的總結(jié)性發(fā)現(xiàn)。（B ） CHRNA5中 rs16969968 的實驗結(jié)果。 （C ）通過熒光素酶報告基因檢測確定 rs6495309 對CHRNA3的調(diào)控活性。肺癌風(fēng)險相關(guān)等位基因用紅色陰影表示，保護(hù)性等位基因用藍(lán)色陰影表示。

CHRNA3 eQTL 在 GTEx 肺組織中也很重要，較低水平與風(fēng)險相關(guān)。在對 CHRNA3 rs6495309（在中國人群中報告，與 EUR 中的 rs55781567 相比，LD R2 = 0.0175）的實驗評估中，啟動子區(qū)域的變異被證明會影響 Oct-1 結(jié)合親和力，風(fēng)險等位基因 C 導(dǎo)致肺組織中 CHRNA3 的表達(dá)增加（與 TWAS 相反；圖 1C）。此外，CHRNA3 的表觀遺傳沉默 導(dǎo)致肺癌細(xì)胞在尼古丁存在下凋亡和 Ca2+ 內(nèi)流受到抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明，15q25.1 上的變異可能通過 nAChR 蛋白功能和這些基因的表達(dá)影響肺癌風(fēng)險。

除了 nAChR 亞基基因外，該區(qū)域中的其他一些基因也在肺癌發(fā)展中獲得了功能支持。增殖和凋亡試驗表明，PSMA4（蛋白酶體 α-4 亞基異構(gòu)體 1）的敲低顯著降低了肺癌細(xì)胞系的生長并增加了其凋亡。一項 TWAS 研究一致表明，正常肺組織中較高水平的 PSMA4 與肺癌風(fēng)險相關(guān)。在同一項研究中，IREB2（鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 2）是 15q25.1 上與肺癌最密切相關(guān)的基因，較低水平的基因與風(fēng)險相關(guān)。此外，IREB2 的敲低增加了永生化肺成纖維細(xì)胞中的 DNA 損傷，表明存在通過 DNA 損傷和修復(fù)途徑的潛在機制。另一項研究發(fā)現(xiàn)，rs2036534 的風(fēng)險等位基因 C（EUR 中 rs55781567 的 R2 = 0.1803）與肺癌中 IREB2 表達(dá)增加相關(guān)（圖 1A）。總之，這些發(fā)現(xiàn)為該位點背后的 nAChR 基因提供了強有力的支持，并表明除了吸煙行為之外，腫瘤發(fā)生中還存在一種涉及其他基因的更復(fù)雜的機制。

端粒生物對肺癌發(fā)生的影響

5p15.33 基因座是眾所周知的多癌基因座，與不同人群的肺癌相關(guān)。最強的信號是 rs2736100，在歐洲和東亞人群的吸煙者和從不吸煙者中持續(xù)觀察到。一項功能研究發(fā)現(xiàn)，rs2736100 在肺細(xì)胞中通過熒光素酶報告基因檢測顯示出潛在的增強子活性，肺癌風(fēng)險相關(guān)的 C 等位基因與正常和肺腫瘤組織中 TERT (端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶) 的較高表達(dá)相關(guān) (圖 2A) 。TERT 編碼端粒酶復(fù)合物的催化亞基，一旦重新激活，細(xì)胞就能避免衰老，并通過維持端粒長度和染色體完整性促進(jìn)癌癥發(fā)展 。值得注意的是，rs2736100-C 等位基因與外周白細(xì)胞中較長的端粒長度相關(guān)（圖 2A）。此外，基因預(yù)測的較長端粒長度和白細(xì)胞中較長的端粒長度與肺癌風(fēng)險增加相關(guān)。

圖 2：肺癌 GWAS 基因座 5p15.33、6p21 (MHC) 和 6p22.1 的功能性發(fā)現(xiàn)總結(jié)。( A ) 圍繞基因TERT和CLPTM1L的總結(jié)性發(fā)現(xiàn)。( B ) 對 6p21 處 MHC 區(qū)域的條件精細(xì)定位分析。 ( C ) rs17079281 對DCBLD1表達(dá)的調(diào)節(jié)機制及其功能性后果。肺癌風(fēng)險相關(guān)等位基因以紅色表示，保護(hù)性等位基因以藍(lán)色表示。

不同人群的 GWAS 和逐步條件分析已在該基因座中發(fā)現(xiàn)了更多的獨立信號（在以領(lǐng)先 SNP 作為回歸分析的協(xié)變量時仍然顯著）。rs36115365 的肺癌保護(hù)性 C 等位基因優(yōu)先招募轉(zhuǎn)錄因子 ZNF148，這會增加肺癌細(xì)胞系中的TERT表達(dá)，但不會增加CLPTM1L。肺癌細(xì)胞系中 ZNF148 的消耗也會降低端粒酶活性并增加端粒長度。值得注意的是，相同的 rs36115365-C 等位基因會增加胰腺癌和睪丸癌的風(fēng)險，但會降低肺癌和黑色素瘤的風(fēng)險，盡管TERT的變異功能在不同癌細(xì)胞類型中始終存在。

一些精細(xì)定位變異的功能注釋也表明 CLPTM1L 參與了該基因座。rs31489 與正常肺組織中的 CLPTM1L 水平顯著相關(guān)，風(fēng)險等位基因 C 與更高的表達(dá)相關(guān) (圖 2A)。與此觀察結(jié)果一致，據(jù)報道 LUAD 組織中的 CLPTM1L 表達(dá)水平高于正常肺組織。功能研究表明，在小鼠模型中，CLPTM1L 是 K-Ras 誘導(dǎo)的肺腫瘤發(fā)生所必需的，而 CLPTM1L 的敲低使肺腫瘤細(xì)胞對基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。這些研究表明，CLPTM1L 的敲低可以作為阻止 KRAS 突變腫瘤生長的潛在治療方法。這些數(shù)據(jù)支持 TERT 是該基因座中最可能的肺癌易感基因，但也支持 CLPTM1L 的參與。鑒于該基因座遺傳信號的復(fù)雜性，需要使用高通量方法全面識別多種功能變異及其各自的靶基因。