【腫瘤基因檢測】腫瘤患者靜脈血靶向藥物基因檢測正確性高嗎？

靶向藥物基因檢測導讀：

腫瘤靶向藥物技術(shù)研究收集兩組晚期非小細胞肺癌（NSCLC)患者的外周血樣本,提取cfDNA進行Axen檢測板靶向測序,并與組織活檢結(jié)果進行比較,旨在評估ctDNA檢測與組織活檢的一致性。結(jié)果顯示,對EGFR、KRAS等常見突變,兩種檢測高度一致;而對某些少見突變的檢測,ctDNA與組織活檢的一致性較低。該流程標準化了ctDNA提取、靶向測序和生物信息學分析,以保證檢測結(jié)果的正確性。結(jié)果表明,ctDNA能正確檢測多數(shù)常見驅(qū)動突變,但對部分少見突變檢測仍需優(yōu)化。該流程為ctDNA檢測技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化提供了Protocol,有助于推動基于ctDNA的無創(chuàng)檢測在非小細胞肺癌（NSCLC)正確醫(yī)學中的應用。
 

患者入組

入組標準為腫瘤靶向藥物基因檢測合作醫(yī)院醫(yī)院確診的20歲以上非小細胞肺癌患者。根據(jù)不同時間點的樣本收集,將患者分為兩個隊列(A隊列和B隊列)。A隊列包括新診斷的晚期或反復性非小細胞肺癌（NSCLC)患者,在進行一線系統(tǒng)化療前取樣作為baseline。B隊列包括正在進行分子靶向治療或免疫檢查點抑制劑治療的晚期或反復性非小細胞肺癌（NSCLC)患者,這些患者之前治療取得腫瘤縮小但后來進展。排除標準為過去三年內(nèi)有其他腫瘤病史的患者,或存在小細胞癌成分的患者。

本研究遵循赫爾辛基宣言(2013年修訂版),經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者簽署知情同意書。

血樣收集及cfDNA提取

所有入組患者在每次臨床隨診時進行常規(guī)血液采樣,同時在知情同意下額外采集研究用血樣。A隊列患者在開始治療時、第二周期化療前和確診疾病進展時各采集三份血樣。B隊列患者在入組后按照治療反應評估時間表定期采血,疾病進展時采集最后一份血樣?？紤]到時間和費用限制,本研究僅分析了A隊列baseline時的樣本及B隊列疾病進展時的樣本。

每位患者采集約10ml全血,使用Roche細胞游離DNA收集管,4°C下1000g離心10分鐘。收集上清5ml用于提取cfDNA,使用QIAamp Circulating Nucleic Acid試劑盒提取cfDNA,-70°C至-80°C保存。用Qubit dsDNA HS試劑盒和2100生物分析儀檢測提取cfDNA的濃度和總量。

腫瘤組織基因分型和靶向測序

初診時所有患者的FFPE腫瘤組織樣本進行驅(qū)動基因檢測以指導臨床用藥。EGFR外顯子19缺失和外顯子21 L858R突變通過PANA Mutyper試劑盒檢測。ALK融合通過VENTANA ALK (D5F3) IHC和(或)FISH斷裂信號檢測。PD-L1表達通過免疫組化檢測,使用抗體包括22C3 pharmDx、Ventana SP263。

靶向測序的腫瘤組織DNA從FFPE切片中提取,使用QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒提取,電泳和Qubit法對提取DNA進行質(zhì)量控制。

靶向測序和變異檢出分析

ctDNA和腫瘤組織DNA均使用Axen Cancer Panel 2進行靶向測序,覆蓋171個基因和25個融合基因重排,測序深度約為4000X。reads比對參考基因組hg19,使用GATK4.1.2和MuTect2從align過的reads中檢出體細胞變異。使用ANNOVAR數(shù)據(jù)庫對變異進行注釋,篩選標準包括:gnomAD和NARD數(shù)據(jù)庫報告頻率小于1%的外顯子變異、預測為有害的變異、在ClinVar數(shù)據(jù)庫中無良性記錄的變異等。進一步濾除not達到MuTect2似然比閾值及base quality要求的變異。對組織樣本設置測序depth>200,VAF>5%的過濾條件;對ctDNA樣本,由于低豐度的變異,設depth>50,變異reads數(shù)>10為閾值。統(tǒng)計變異總數(shù)計算TMB。使用COSMIC數(shù)據(jù)庫識別與肺癌相關(guān)的變異。

統(tǒng)計學分析

使用R 4.1版本進行統(tǒng)計分析。采用秩和檢驗和卡方檢驗分析臨床特征差異。使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)評估變量相關(guān)性。OS定義為A隊列從入組起至死亡時間,B隊列從疾病進展起至死亡時間。應用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,Log-rank檢驗進行組間比較。計算ctDNA相對組織檢測的敏感性和正確度。

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