【佳學(xué)基因檢測】二代測序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤正確醫(yī)學(xué)診斷的共識

【佳學(xué)基因檢測】二代測序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤正確醫(yī)學(xué)診斷的共識

先進版（試行）2016.04.23
 

腫瘤基因檢測導(dǎo)讀：

佳學(xué)基因是一個充分挖掘基因信息在各個領(lǐng)域的價值的專業(yè)機構(gòu)。對于腫瘤與癌癥來說，基因解碼充分利用基因信息指導(dǎo)腫瘤遺傳性分析與明確、腫瘤與癌癥尤其是肺癌的早期診斷與治療?；虻慕獯a信息還被應(yīng)用于腫瘤靶向藥物、個性化藥物的開發(fā)與臨床應(yīng)用。正確的利用基因信息首先需要全面、正確的獲得基因序列。而二代測序是獲取肝癌、腸癌、乳腺癌患者腫瘤治療信息的先進步，通過基因解碼而不是基因檢測是建立基因序列與腫瘤癌變、轉(zhuǎn)移和治療關(guān)系的另一個至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

 

中國腫瘤驅(qū)動基因分析聯(lián)盟（CAGC）
中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）

共識摘要：

本專家組代表中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）及中國腫瘤驅(qū)動基因分析聯(lián)盟（CAGC）提供二代測序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤驅(qū)動基因分析的相關(guān)指導(dǎo)性建議。專家組由實驗室癌癥遺傳學(xué)家、臨床腫瘤學(xué)家、生物信息學(xué)專家、病理學(xué)家和其他人員組成。建議內(nèi)容在多次討論修改后定為初步共識，主要包括NGS技術(shù)應(yīng)用需求及相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測內(nèi)容、測序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告、技術(shù)質(zhì)量認證和驗證等方面的基本要求與規(guī)范。

背景：

當(dāng)今的腫瘤診治已經(jīng)進入個體化及正確醫(yī)學(xué)時代，需要充分分析腫瘤從發(fā)生到轉(zhuǎn)歸的整個疾病進程中的驅(qū)動基因及其變異，從而選擇有效的靶向治療方案。為此，中國臨床腫瘤學(xué)會于2015年9月17日在廈門市召集了我國具有代表性的腫瘤學(xué)專家、病理及分子生物學(xué)專家及NGS技術(shù)專家，成立了“中國腫瘤驅(qū)動基因分析聯(lián)盟”（China Actionable Genome Consortium，CAGC）并啟動了正確腫瘤學(xué)研究項目（Precision Oncology Initiative，即CAGC POI），確立了整體項目的組織框架和內(nèi)容框架。CAGC-POI計劃先進階段擬在初步建立二代測序技術(shù)（next generation sequencing, NGS）臨床應(yīng)用共識的基礎(chǔ)上，在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性實體瘤開展以NGS技術(shù)為主的驅(qū)動基因譜分析。2015年9月27日經(jīng)CSCO理事長吳一龍教授與中華醫(yī)學(xué)會會長陳竺院士和陳賽娟院士討論后決定，將造血系統(tǒng)腫瘤作為第6個瘤種納入CAGC POI計劃，主要是針對白血病等開展較之以前更為廣泛的基因變異譜分析。在上述共識建立、主要6個瘤種的變異譜分析驗證、優(yōu)化流程的基礎(chǔ)上，將在攜帶有臨床“可靶向作用”驅(qū)動基因的患者中，開展相應(yīng)的靶向正確診治的實踐與試驗研究。賊終提出適合我國臨床腫瘤學(xué)實踐的NGS檢測技術(shù)、分析內(nèi)容、診治模式的共識、標準和規(guī)范，克服NGS實驗室與臨床應(yīng)用之間的障礙，提高為腫瘤患者服務(wù)的質(zhì)量和能力。

本階段共識建立是CAGC POI項目的先進階段，將由專家組提出NGS技術(shù)在臨床腫瘤學(xué)應(yīng)用的共識內(nèi)容。在廣泛收集相關(guān)的建議和意見的基礎(chǔ)上，修訂為指導(dǎo)下一階段技術(shù)檢測的共識性文件，供腫瘤學(xué)相關(guān)臨床和檢測人員等參考。

技術(shù)引言：

當(dāng)今的二代測序技術(shù)（NGS）是高通量的大規(guī)模平行測序技術(shù)，可同步獲得腫瘤患者個體特定樣本中數(shù)十億以上的DNA堿基序列信息。NGS有明顯的通量優(yōu)勢及發(fā)現(xiàn)未知基因變異的優(yōu)勢，但是在使用中也存在包括檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)管理、分析與報告、解讀與臨床咨詢等方面的各種挑戰(zhàn)。既往的文獻及國際相關(guān)共識已經(jīng)總結(jié)和報道了NGS在單基因遺傳病、產(chǎn)前診斷等方面的應(yīng)用。而在臨床腫瘤學(xué)的實踐中，基因檢測已經(jīng)成為正確診治的前提和核心內(nèi)容之一，但缺乏統(tǒng)一的共識。腫瘤基因檢測范圍越來越廣，已經(jīng)由單基因的分析，逐步走向數(shù)個至數(shù)百個基因的多重分析。在未來，腫瘤臨床實踐中甚至可能需要針對外顯子組、轉(zhuǎn)錄組、全基因組、表觀遺傳組的信息分析和應(yīng)用。另一方面，由于生物技術(shù)也在不斷進步，因此可以預(yù)見的是，在未來的一段時間，高通量技術(shù)NGS在臨床診斷和正確治療中的應(yīng)用將會在檢測技術(shù)、分析內(nèi)容、解讀等方面會一直產(chǎn)生變化，也會帶來在實踐應(yīng)用中的各種挑戰(zhàn)。

在現(xiàn)階段，我國社會的腫瘤患者數(shù)目龐大，驅(qū)動基因診斷和檢測應(yīng)用需求巨大。但在實際應(yīng)用中會因為檢測技術(shù)的準入門檻低、缺乏臨床公認的NGS指導(dǎo)規(guī)范，腫瘤診治中可能存在檢測質(zhì)量低下、結(jié)果正確性差，檢測結(jié)果解讀不專業(yè)，甚至盲目追求基因檢測結(jié)果的現(xiàn)象。因此，我國腫瘤學(xué)界亟需對當(dāng)前NGS在臨床合理規(guī)范的使用進行充分討論，形成共識予以發(fā)布，以指導(dǎo)我國臨床腫瘤診療中的規(guī)范應(yīng)用。

本技術(shù)共識闡述了NGS技術(shù)質(zhì)量需求、臨床腫瘤相關(guān)NGS檢測內(nèi)容、樣本處理、測序流程、數(shù)據(jù)管理、信息學(xué)分析、結(jié)果報告解釋和咨詢等多個方面的內(nèi)容。本共識也對患者知情同意、測試項目的質(zhì)控、研究與診斷的應(yīng)用差別等內(nèi)容進行了說明。
 

1. NGS在臨床腫瘤診斷中的質(zhì)量需求：

NGS技術(shù)正處于不斷的發(fā)展和完善過程中，需要對NGS技術(shù)現(xiàn)狀有正確的認識。但過去十年腫瘤學(xué)界的研究和應(yīng)用顯示：在恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)條件下，NGS確實能夠高通量地檢測分析腫瘤中的驅(qū)動基因，給部分患者帶來治療和生存的獲益。

在臨床實踐中各實驗室可能有不同的NGS技術(shù)平臺。無論使用何種平臺，各實驗室均應(yīng)該按照本共識中的推薦（聲明）開展NGS項目測試，對平臺及相關(guān)分析工具進行驗證后才應(yīng)用于臨床。

針對腫瘤的多基因檢測，需要設(shè)計特定的NGS測試項目（test）。這些項目的檢測結(jié)果應(yīng)能夠明確回答臨床診療所需的基因狀態(tài)。需要明確指出的是，應(yīng)該避免分析技術(shù)能力尚未得到充分驗證的NGS項目在臨床應(yīng)用。

聲明1：臨床腫瘤診斷應(yīng)用的NGS項目應(yīng)符合相應(yīng)的診斷技術(shù)標準。未進行充分驗證的NGS技術(shù)不應(yīng)該在臨床實踐的驅(qū)動基因診斷中應(yīng)用。相關(guān)實驗室應(yīng)該明確能夠提供的檢測項目的內(nèi)容范圍和相關(guān)技術(shù)參數(shù)。

（注：文中的“聲明”（statement）是專家組討論的各個要點，也即專家組形成的共識或推薦）

NGS用于臨床腫瘤分子診斷能夠帶來明確的益處（utility）。NGS技術(shù)優(yōu)勢：一次性、特定時間（約10個工作日）產(chǎn)生覆蓋基因組特定區(qū)域（從數(shù)個基因到數(shù)百個基因以至外顯子組、轉(zhuǎn)錄組或全基因組）的通量數(shù)據(jù)，同步獲得多基因、多位點、多種變異形式的分子檢測結(jié)果。盡管目前NGS的多基因多重分析總成本較高，但相對于傳統(tǒng)檢測方法而言，單個基因單個位點的檢測費用已大大下降。

影響NGS結(jié)果的限制性因素包括：平臺類別、靶區(qū)域富集方法、文庫構(gòu)建及擴增效率、測序數(shù)據(jù)量、生物信息學(xué)分析流程等。在臨床應(yīng)用之前，對于特定突變位點的NGS檢測結(jié)果在低質(zhì)量數(shù)據(jù)條件下應(yīng)采用其他方法進行結(jié)果驗證。檢測實驗室的專家、腫瘤患者的主診醫(yī)生與患者應(yīng)該就開展腫瘤NGS分析的利弊進行充分溝通和知情同意，同時讓臨床醫(yī)生了解特定NGS測試項目的醫(yī)學(xué)意義。

聲明2：NGS檢測項目（Test）的目的和臨床益處（utility）應(yīng)該明確，如果是用于臨床靶點抑制劑（靶向藥物）的使用決策參考，檢測結(jié)果應(yīng)該能夠明確一些在臨床可采取特定藥物靶向治療的靶點變異信息。NGS測試項目如果是用于分子分型、療效預(yù)測或預(yù)后判斷則需要在發(fā)現(xiàn)集（discovery set）的基礎(chǔ)上建立分析模型，再通過技術(shù)和驗證集（validation set）的驗證方可進一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。

2. NGS在臨床腫瘤應(yīng)用的檢測內(nèi)容：

在臨床實踐中，不同的瘤種既可存在瘤種特異性的驅(qū)動基因變異，也可能存在共同的基因變異。一個瘤種存在眾多的分子變異亞型，從而提出“同病異治”或“分型而治”的策略；不同瘤種之間由于存在共同的驅(qū)動基因分型，則可以采取“異病同治”的策略。由此可見，臨床腫瘤的基于基因或基因組學(xué)的分子分型將逐步超越傳統(tǒng)的病理組織形態(tài)學(xué)分型，成為臨床診治腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

腫瘤的多基因分型對藥物研發(fā)策略也產(chǎn)生了重大影響。在藥物臨床試驗設(shè)計方面，近年來出現(xiàn)了兩種基于分子靶點的試驗研究設(shè)計類型。一種是“雨傘”設(shè)計類型（Umbrella trial design），即針對單個瘤種的基于多個驅(qū)動基因分型及其靶向治療，另一種則是“籃子”設(shè)計類型（Basket trial design），是針對多個瘤種的驅(qū)動基因的“同型同治”。

無論是臨床實踐還是臨床試驗，用于基因分型的NGS檢測項目內(nèi)容需要精細的設(shè)計和技術(shù)高效性的驗證。NGS項目的檢測內(nèi)容應(yīng)明確檢測哪些基因、相應(yīng)基因的受檢區(qū)域、靶點的變異信息等。

聲明3：如果NGS用于臨床分子診斷，應(yīng)該明確至少哪些基因需要納入檢測名單（panel list）中。這個必須的“核心基因清單”（core gene list）需要特定腫瘤亞?？葡嚓P(guān)的臨床和實驗室多學(xué)科專家共同討論后制定。

“核心基因清單”論證及制定過程中應(yīng)以“患者的利益”為中心，充分整合臨床腫瘤學(xué)家對于正確診治的觀點，并充分考慮在我國推廣應(yīng)用的可操作性。以肺癌為例: 目前NCCN及國內(nèi)肺癌臨床指南或衛(wèi)計委診療規(guī)范都明確指出EGFR突變、KRAS突變、ALK重排（融合）、ROS1重排（融合）、MET 14號外顯子可變剪切變異、MET拷貝數(shù)擴增、RET重排（融合）、HER2突變或擴增、BRAF突變等驅(qū)動基因變異是臨床實踐中的重要必須基因。

從CAGC POI項目的惡性腫瘤的整體角度考慮，檢測內(nèi)容（gene panel及其基因組區(qū)域）應(yīng)該既包括各瘤種特異性的panel，也應(yīng)備有一個大而全的gene panel。因?qū)嶓w瘤和血液腫瘤的變異譜方面的差異較大，因此，在大而全的panel中對實體瘤和血液腫瘤應(yīng)該分別設(shè)計。

“可靶向作用”的原理及定義：驅(qū)動基因的定義是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等疾病進程中關(guān)鍵步驟的基因。“可靶向作用”基因則是指針對該驅(qū)動基因的變異靶點或其上下游關(guān)鍵分子，能夠采用靶向藥物等手段進行治療，從而達到抑制腫瘤進展或消退腫瘤的治療效果?？砂邢蜃饔没蛞部芍冈摶虻淖儺惪梢杂脕碜鳛槊鞔_的分子亞型診斷或預(yù)后判斷。

聲明4：“可靶向作用基因”的變異可能會影響臨床決策，醫(yī)生需要根據(jù)基因分型的檢測結(jié)果來指導(dǎo)臨床診療方案。“可靶向作用基因”的變異可分為兩大類，先進類（Level 1 actionable alterations）包括國際、國內(nèi)指南（CSCO、ASCO、NCCN、ESMO等）中明確指定的、藥物標簽中說明的、與FDA/CFDA批準的適應(yīng)癥相關(guān)的臨床分型基因變異，或是具有明確的分子診斷或預(yù)后判斷價值的基因變異。第二類（Level 2 actionable alterations）包括正在開展的任何期別（I-III期）臨床試驗中的藥物相關(guān)靶點、在已經(jīng)或即將開展的臨床試驗中作為入組條件的變異靶點、在國內(nèi)外指南中其他腫瘤或疾病適應(yīng)癥的藥物靶點、用于輔助診斷或預(yù)后判斷的靶點等。在NGS檢測中，對于臨床意義非常明確的體細胞突變的少數(shù)基因集分析，可以直接檢測腫瘤標本而無須設(shè)置白細胞等對照樣本。但對于需要包含上述第二類可靶向作用基因的更大的基因集分析，尤其是數(shù)百基因乃至全外顯子組測序等，建議在腫瘤樣本進行NGS檢測時設(shè)置患者自身白細胞樣本對照分析。

聲明5：隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展機制研究的不斷深入，新的靶點及藥物會得到不斷的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)。因此有必要定期或不定期依據(jù)重要的臨床研究進展對檢測內(nèi)容進行討論并發(fā)布更新。

聲明6：檢測基因數(shù)量越多，診斷信息會越多。但由于腫瘤信號通路的冗余性和復(fù)雜性，在基因清單中，除了“核心基因”之外，應(yīng)該對其他增加的每個基因進行明確定義注釋，說明其基因型與潛在可靶向作用位點或通路的關(guān)系。在實際的NGS測試項目應(yīng)用中，檢測基因數(shù)量的增加不應(yīng)以核心基因的檢測質(zhì)量受損為代價。

技術(shù)參數(shù)驗證對高效檢測結(jié)果的正確性很重要。所有NGS計量參數(shù)都應(yīng)該明確說明。在檢測中應(yīng)該記錄批次或分析樣本特異性的特征。檢測實驗室應(yīng)該利用結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫來高效平臺、各分析項目、樣本處理等方面的質(zhì)量分析。在檢測分析流程中，每個樣本都應(yīng)該做好少有性標識。在平臺穩(wěn)定性驗證中，應(yīng)該使得所有儀器和試劑都符合標準要求，提供特定驅(qū)動基因的正確性和正確性。
技術(shù)驗證過程中應(yīng)該記錄在案的相關(guān)內(nèi)容或參數(shù)包括以下幾方面。1．樣本相關(guān)的患者信息保護原則、少有性標識、接收、存儲、處理各步驟內(nèi)容及時間；2. 實驗操作過程中DNA/RNA處理每一步驟所用試劑名稱、生產(chǎn)廠家、批號，記錄每一步操作后的質(zhì)量指標（如RIN等）；3．?dāng)?shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)庫管理相關(guān)的軟件（包括版本號，分析時所用各項參數(shù)）、數(shù)據(jù)的相關(guān)參數(shù)（數(shù)據(jù)量大小，QC等）、數(shù)據(jù)庫的安全性和備份情況等。

聲明7: NGS項目的檢測流程和生物信息學(xué)分析需要針對特定平臺和分析項目進行充分優(yōu)化。流程驗證中應(yīng)提供分析敏感性和特異性的參數(shù)。因為分析方法的差異，針對SNV、INDEL、重排（融合）、CNV等不同的變異應(yīng)該分別測試技術(shù)的敏感度和特異度。受樣本取材或探針設(shè)計等因素影響或限制，NGS在某些變異類型如拷貝數(shù)擴增的檢測方面有時存在一定的局限性。對于NGS方法正確性可能有影響的情況，應(yīng)考慮采用高效的單基因方法對檢出變異進行驗證。
 

3. NGS應(yīng)用中的樣本處理：

NGS檢測需文庫構(gòu)建，該步驟原始材料為DNA或來自RNA的cDNA。適合臨床NGS分析的樣本類型優(yōu)先選擇新鮮組織標本，也可選用甲醛固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）樣本、腫瘤細胞學(xué)標本及血漿（游離DNA/RNA）等。

NGS可用于疾病初診時的分子靶點分析，也可用于治療中疾病進展狀態(tài)的監(jiān)測及耐藥分子機制的診斷。因而在疾病的全程管理中可合理地考慮在診療的關(guān)鍵時間節(jié)點收集臨床標本進行NGS分析。決定是否采用NGS在多個時間節(jié)點的檢測分析應(yīng)做好多學(xué)科討論和充分的知情同意。

各類樣本采集：（1）對于手術(shù)和活檢的新鮮組織：理想的保存方法是迅速置于液氮中，可保存于液氮罐或-80℃冰箱，該過程應(yīng)在手術(shù)離體后30分鐘內(nèi)完成，以防止RNA等核酸降解；或采用保存在樣本保護劑中，盡早轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存。可采用冷凍切片染色評估樣本中的腫瘤細胞含量。（2）甲醛固定石蠟包埋組織（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）：按病理操作規(guī)范進行取材。手術(shù)或活檢離體的組織應(yīng)在30分鐘內(nèi)浸入10%中性福爾馬林溶液中進行固定，避免使用酸性及含有重金屬離子的固定液。大標本應(yīng)切開后充分固定至6-48小時，不超過72小時。小活檢標本可固定6-12小時。開展NGS檢測前應(yīng)進行HE染色評估腫瘤細胞的含量。（3）細胞學(xué)樣本：胸腹水中的腫瘤細胞用于基因檢測時，必須確認是否有腫瘤細胞存在。細胞病理檢查之后，符合質(zhì)量要求的標本可直接抽提核酸，也可以制備成FFPE細胞學(xué)蠟塊進行后續(xù)分析。（4）血漿或血液樣本：循環(huán)游離/腫瘤DNA(circulating free/tumor DNA，cf/ctDNA)是存在于血漿中的游離DNA，腫瘤來源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊。采集外周血提取血漿游離DNA進行檢測，取樣時應(yīng)使用一次性的EDTA抗凝真空采血管，采集8~10ml全血，冷藏運輸，2小時內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需要長時間運輸，建議用商品化的游離DNA樣本專用保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存3－7天。由于血細胞基因組DNA（gDNA）的潛在大量釋放會極大地稀釋血漿游離腫瘤DNA的濃度，經(jīng)肉眼觀察確認為溶血的樣本不適用于對游離腫瘤DNA的NGS檢測。當(dāng)懷疑血漿游離DNA受到血細胞基因組DNA污染時，可考慮采用核酸片段大小分布分析來判斷污染是否存在，而從判斷樣本是否適用于NGS檢測。

采樣質(zhì)量的評價對后續(xù)結(jié)果的解讀有重要意義，臨床樣本的采樣過程、分析前的運輸和處理流程以及病理的評估結(jié)果等均應(yīng)做相應(yīng)的記錄。質(zhì)量評價的內(nèi)容應(yīng)包括腫瘤細胞含量比例、腫瘤細胞的數(shù)量，是否按照要求進行處理與運輸?shù)?。評價方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和血漿樣本核酸濃度分析等。對于腫瘤細胞分布集中的區(qū)域應(yīng)進行標注，必要時進行顯微切割后再提取核酸。
樣本采集和處理中的防污染：樣本采集賊好采用一次性材料；制備不同患者病理切片樣本時，需更換新刀片，并清除操作器皿或切片機上先前樣本的殘留。

樣本運送和保存：實驗室應(yīng)建立詳細的樣本運送標準操作規(guī)程（SOP），對臨床醫(yī)生提供樣本采集手冊，要求物流人員填寫相關(guān)運送記錄表，確保運送過程中各類樣本的安全性和過程的可控性。石蠟材料可常溫運輸，血漿樣本干冰條件下運輸，核酸樣本需要在4攝氏度或冷凍條件下運輸。

聲明8：為了提高NGS檢測腫瘤驅(qū)動基因的正確性，應(yīng)該提供高質(zhì)量的臨床生物材料樣本。不同類型生物材料的收集及處理均應(yīng)有明確的標準操作流程（SOP）指導(dǎo)。

聲明9：樣本登記過程中每個標本應(yīng)該在NGS分析中有少有性標識。包括來自同一患者的不同組織病灶、不同組織切片、不同核酸樣本等均有少有性的標識。

聲明10：樣本評估和用量：除了血漿或血液來源的DNA/RNA，凡是涉及形態(tài)學(xué)的標本，應(yīng)該在顯微鏡下評估腫瘤細胞的含量，充分記錄各類形態(tài)學(xué)惡性細胞的含量比例。評估記錄還應(yīng)包括標本收集和處理方法。腫瘤細胞比例低的標本必要時應(yīng)采用包括顯微微切割在內(nèi)的有效富集腫瘤細胞的方法，提高腫瘤細胞比例。一般情況下，適合于NGS檢測的組織標本中腫瘤細胞含量建議應(yīng)達到20%以上。如果腫瘤細胞占比較低，患者知情后依然愿意進行NGS檢測，應(yīng)該盡量采用顯微切割技術(shù)富集腫瘤細胞，或增加NGS測序 數(shù)據(jù)量以提高測序覆蓋深度（depth），并在報告中提示樣本局限性。組織樣本抽提獲得的DNA量應(yīng)達50ng以上用于NGS檢測。血液樣本建議采血至少8ml，分離血漿游離DNA用于NGS檢測。

聲明11：核酸樣本抽提及QC/QA。組織DNA與血漿游離DNA等核酸樣本均應(yīng)進行檢測前的質(zhì)量控制分析，包括核酸的濃度和純度分析。組織DNA樣本應(yīng)該進行核酸完整性分析，以判斷DNA質(zhì)量。血漿游離DNA樣本應(yīng)該進行片段長度分布分析，以判斷是否存在血細胞基因組DNA的污染。在文庫構(gòu)建后應(yīng)該對核酸樣本進行濃度測定與文庫片段分布等質(zhì)量控制。

聲明12：為了便于后續(xù)采用其他技術(shù)方法對檢測結(jié)果進行驗證，在樣本留取時，應(yīng)適當(dāng)考慮增加生物材料的留取量。在石蠟標本的切片過程中可考慮適當(dāng)同步預(yù)留幾張切片用于后續(xù)IHC、FISH、PCR測序等方法驗證。

4. NGS測序 技術(shù)及流程：

NGS又稱大規(guī)模平行測序（MPS），是一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測序技術(shù)，是繼Sanger測序之后的革命性進步。NGS能夠同時對上百萬甚至數(shù)十億個DNA分子進行測序，實現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測序的目標。高通量測序技術(shù)不僅可以進行大規(guī)模基因組序列的測序，還可用于基因表達分析、非編碼小分子RNA的鑒定、DNA甲基化等相關(guān)分析。

目前在臨床腫瘤實踐中，NGS主要應(yīng)用于驅(qū)動基因測序，是腫瘤正確診療的重要環(huán)節(jié)。NGS的優(yōu)勢包括：一次性通量測序、能夠分析變異豐度、相對成本低。存在的不足之處包括：滿足臨床應(yīng)用的生物信息分析軟件尚處于發(fā)展之中、基因型的判讀依賴于生物信息的正確分析、測序深度在必要時因整體成本高而難以達到等。

就NGS技術(shù)本身而言，在臨床腫瘤診斷和監(jiān)測中的應(yīng)用應(yīng)充分關(guān)注試劑管理、樣本的QA/QC、檢測環(huán)境、人員資質(zhì)和熟練程度、NGS技術(shù)參數(shù)標準（包括文庫構(gòu)建、測序流程、質(zhì)控等）等環(huán)節(jié)，以標準操作規(guī)范加以約束，以高效特定腫瘤NGS測試（test）能夠穩(wěn)定正確地發(fā)揮作用。

測序技術(shù)的各個環(huán)節(jié)應(yīng)該做好實驗室規(guī)范記錄，賊好有結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫進行管理，包括平臺環(huán)境參數(shù)、試劑使用和性能、樣本追蹤、質(zhì)控數(shù)據(jù)等管理。通過日常和定期分析質(zhì)控高效檢測的正確性。
為滿足臨床需求，實驗室需對各個質(zhì)量控制步驟出現(xiàn)異常、失敗的樣本規(guī)定合理的備選方案。比如采用其他分子診斷平臺檢測一部分重要位點，或?qū)﹃栃晕稽c采用其他平臺確認性檢測，或者重復(fù)高通量測序流程等，有條件的檢測單位也可以重新選取標本。

聲明13：NGS檢測需要符合嚴格的檢測環(huán)境要求，各類樣本的儲存、核酸抽提處理及NGS分析應(yīng)在通過審核驗收的臨床基因擴增檢驗實驗室完成。

聲明14：NGS試劑管理和質(zhì)控：NGS試劑應(yīng)該獨立存放，防止交叉污染。對于實驗室自配試劑或探針及采購試劑，均需做好每批試劑的性能評價，評價合格后才可用于臨床樣本分析。

聲明15：每個特定的NGS測試項目（test）都需要經(jīng)過嚴格的技術(shù)驗證合格后才可以用于臨床腫瘤檢測。診斷測試項目必須在正確性、分析敏感度、特異度、正確性等方面進行充分評價。如果檢測項目中的試劑或步驟有任何主要變更，則質(zhì)量參數(shù)需要重新評價。在針對檢測項目更新或升級的重新評價中，應(yīng)該明確測試所需要的樣本類型及例數(shù)。強烈建議各實驗室參加NGS相關(guān)的室間質(zhì)量評估項目來評測檢測能力和質(zhì)量。

聲明16：明確的檢測流程包括樣本QC/QA、樣本預(yù)處理、接頭連接、預(yù)擴增、基因組合（gene panel）靶區(qū)的捕獲、靶區(qū)純化、擴增文庫構(gòu)建、QC定量后上NGS測序 儀檢測等步驟。每個步驟的操作和質(zhì)量控制都應(yīng)建立SOP進行指導(dǎo)。如果使用擴增子（amplicon）建庫的方式，同樣需要建立相應(yīng)的SOP進行質(zhì)控管理。

聲明17：NGS的技術(shù)標準應(yīng)包括上述樣本預(yù)處理至文庫構(gòu)建、測序、質(zhì)控的技術(shù)標準化，也包括原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生和管理、信息學(xué)分析過程的標準化。由此CAGC將在下一階段可行性驗證基礎(chǔ)上形成一套NGS技術(shù)標準文件（SOP）。

聲明18：人員配備和熟練程度應(yīng)滿足實踐需求。應(yīng)配有專門的質(zhì)控人員。對于參與NGS實驗流程操作的技術(shù)人員進行充分的培訓(xùn)，達到一定的熟練程度。每個平臺應(yīng)有技術(shù)員專職從事實驗操作。

聲明19：“核心基因清單”與相應(yīng)的檢測標準品將被用于各個實驗室間的質(zhì)控比較。根據(jù)檢測驅(qū)動基因的突變結(jié)果描述、目的區(qū)域的覆蓋度等建立評分體系。這個評分體系將用于對實驗室間NGS檢測能力的分析與認證。
 

5. NGS數(shù)據(jù)的產(chǎn)生、管理、信息學(xué)分析：

由于NGS數(shù)據(jù)龐大，數(shù)據(jù)管理、儲存和分析需要強大的計算平臺支持。數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢查、信息學(xué)分析、輸出格式、儲存等方面都應(yīng)有標準SOP支持。賊好有結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫來管理原始數(shù)據(jù)、質(zhì)控數(shù)據(jù)以及分析結(jié)果數(shù)據(jù)等。

聲明20：數(shù)據(jù)分析工具（軟件）的能力驗證。需要采用適量例數(shù)的原始數(shù)據(jù)針對NGS數(shù)據(jù)分析工具進行驗證分析。通過采用攜帶不同種類與豐度變異的數(shù)據(jù)來驗證整個分析流程的正確性與穩(wěn)定性。特別是在增加檢測基因的內(nèi)容時需要驗證分析工具的高效性。分析工具的能力驗證應(yīng)有詳細的內(nèi)部軟件驗證記錄。CSCO CAGC項目也將組織開展軟件分析能力驗證。

聲明21：數(shù)據(jù)產(chǎn)生和管理儲存。檢測實驗室必須采用結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫來注釋SNP、Indel、重排（融合）、CNV等各類變異信息。

聲明22：數(shù)據(jù)儲存應(yīng)該采用通用的FASTQ、BAM、VCF格式，便于數(shù)據(jù)交換及實驗室間評價。同時保存完整的log日志文件，便于區(qū)別流程版本信息、追溯異常結(jié)果來源及分析原始數(shù)據(jù)向診斷報告生成的可重復(fù)性。診斷實驗室應(yīng)該長期保存相關(guān)的數(shù)據(jù)集（至少15年）。

聲明23：NGS原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢查，應(yīng)有嚴格的操作規(guī)程指導(dǎo)。所有參數(shù)需與檢測性能評價過程中的參數(shù)進行比較，設(shè)置并執(zhí)行接受與拒絕的標準。參見表1。

表1. 基于原始序列(FASTQ)和比對后序列(BAM)質(zhì)量的計量參數(shù)

變異檢測質(zhì)量的相關(guān)計量參數(shù)

聲明24：數(shù)據(jù)分析的流程包括初步分析、接頭序列去除、引物序列去除、低質(zhì)量序列去除、參照基因組序列比對（mapping）、去重、Indel重復(fù)比對、堿基質(zhì)量得分校正、突變識別（variant calling）、注釋、過濾后輸出等流程（見下表2）。CAGC POI項目需要在各個瘤種中的每一步都應(yīng)做到同質(zhì)性。

表2. 臨床腫瘤NGS測序 的簡單流程步驟描述

聲明25：體細胞與胚系來源的變異應(yīng)該加以區(qū)分。體細胞突變在腫瘤診療中的臨床意義較大。特定的胚系突變的生物學(xué)意義需要說明，如乳腺癌中BRCA1/2的突變。

聲明26：應(yīng)對各個瘤種中與臨床意義相關(guān)的變異重點進行關(guān)注分析和說明，比如肺癌中的EGFR exons 18-21突變、ALK重排、ROS重排、MET E14拼接變異、HER2插入突變或擴增等突變的說明。

近年來，關(guān)于腫瘤細胞分子異質(zhì)性的研究進展發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在不同分子變異亞型的亞克隆。異質(zhì)性亞克隆的存在會影響腫瘤疾病的整體進化路徑及對靶向治療的應(yīng)答和耐藥。因此NGS用于腫瘤診斷或耐藥監(jiān)測時需要達到較深的測序覆蓋度，這樣才能充分解釋腫瘤轉(zhuǎn)移進化過程中的異質(zhì)性及其與臨床表型的關(guān)系。

聲明27：CAGC建議，臨床腫瘤組織樣本的NGS檢測數(shù)據(jù)中測序“有效深度”應(yīng)該達到 500X以上；血漿游離DNA標本的NGS“有效測序深度”應(yīng)該達到1000X以上。
說明：（1）有效深度定義為去除PCR重復(fù)reads（duplicates）之后的深度；（2）應(yīng)該在80%以上的目標捕獲區(qū)域達到這個深度，而非是所有區(qū)域的平均，否則在區(qū)域間覆蓋波動較大的情況下會有大量區(qū)域出現(xiàn)覆蓋不夠的情況。

聲明28：CAGC項目數(shù)據(jù)的管理應(yīng)該在標準流程和各類數(shù)據(jù)管理方面實現(xiàn)同一化。在后續(xù)將開展每個瘤種約100例的分析，從而對本次共識的可操作性進行驗證。
 

6. NGS結(jié)果報告與咨詢：

NGS是多步驟的復(fù)雜的檢測和分析方法，產(chǎn)生報告的內(nèi)容較多。對臨床而言需要遵循首頁簡明、結(jié)果明確、解釋清楚、信息充分的原則。

在開展NGS臨床測試之前，應(yīng)明確定義所檢測的驅(qū)動基因在基因組上的哪些靶區(qū)域范圍（target range），并在報告中告知臨床醫(yī)生。

NGS報告結(jié)果應(yīng)該簡明清晰。具有臨床靶向意義的檢測結(jié)果及其參數(shù)應(yīng)該優(yōu)先報告，如EGFR L858R突變，突變位點占比（mutant allele fraction, MAF）=15.6%。在報告首頁中應(yīng)包括患者ID、臨床診斷、測試的簡單描述、技術(shù)類型等信息。根據(jù)情況，報告可以適當(dāng)添加附件成多頁。各個瘤種的“核心基因”檢測結(jié)果必須明確報告，其他基因根據(jù)結(jié)果概括性報告，對于特別的突變（如在其他腫瘤中發(fā)現(xiàn)是核心變異）可特別進行報告。

對于生物學(xué)意義未明或未明確分類的變異（Unclassified variants，UVs）結(jié)果應(yīng)該收集整理，并提倡在同行間交換，為賊終確認這些UVs是功能性或非功能性的提供幫助。

對于不同瘤種的NGS數(shù)據(jù)，可以整合到同一個數(shù)據(jù)庫進行分析，這將有助于不同瘤種間變異信息在臨床應(yīng)用中的借鑒。

聲明29：報告格式和內(nèi)容需要標準化，應(yīng)能夠適應(yīng)短期未來的發(fā)展趨勢（靶點知識和檢測內(nèi)容的變更）。請見附件一，臨床腫瘤NGS的報告格式。報告內(nèi)容應(yīng)該包括患者ID、疾病信息、樣本信息、分析技術(shù)信息、主要結(jié)果、結(jié)果解釋、操作員和實驗室專家（腫瘤分子生物學(xué)或遺傳學(xué)專家）簽字等。

聲明30：報告范圍(reportable range)應(yīng)該根據(jù)測試目的以及測序能夠達到質(zhì)量要求的覆蓋范圍來決定。例如在對外顯子組序列的檢測中，在肺癌中不一定報告所有覆蓋區(qū)域中檢出的變異。但需知情臨床醫(yī)生本次報告不能排除潛在的“非關(guān)注區(qū)域”的變異。

聲明31：NGS報告應(yīng)既簡明扼要、明確易懂，又能充分提供必要信息以供醫(yī)生參考用于當(dāng)前臨床的靶向治療方案決策。

聲明32：結(jié)果解釋需客觀中肯，平實地描述腫瘤突變的結(jié)果。在疾病相關(guān)性方面只描述既往研究中的療效或預(yù)測相關(guān)性，不應(yīng)出現(xiàn)建議使用何種治療手段或策略的文字。檢測結(jié)果在臨床決策中的應(yīng)用應(yīng)由臨床醫(yī)生或多學(xué)科專家討論決定。

聲明33：遺傳咨詢需多學(xué)科支持，臨床決策的制定過程中需要與實驗室癌癥遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、病理學(xué)等多方面專家進行必要的信息溝通。

7. 知情同意。

聲明34：NGS檢測項目開展前應(yīng)該向患者做好知情同意或相關(guān)遺傳咨詢（genetic counseling），解釋疾病條件下進行特定NGS檢測分析的目的和利弊。同時需要向醫(yī)生及患者告知測試的局限性，包括驅(qū)動基因的信息、報告范圍、技術(shù)分析的敏感度和特異度等。

知情同意書的內(nèi)容至少必須包含：

（1）進行基因檢測的依據(jù)，其中包括醫(yī)學(xué)指南、專家共識、治療規(guī)范等內(nèi)容，需使患者知悉檢測的意義和目的；

（2）基因檢測過程中可能有的局限性，如提取樣本量是否足夠，樣本質(zhì)量控制指標是否適合基因檢測，如發(fā)生類似情況，需要及時向患者以及家屬說明情況，再決定下一步；

（3）進行基因測序可輔助個體化治療，但是賊終決定須由臨床醫(yī)生決定；

（4）基因檢測結(jié)果要只針對該次送檢樣本；

（5）檢測機構(gòu)必須對患者的身份信息、病例信息以及檢測結(jié)果等保密。患者進行基因檢測之前需知悉以上事項，并簽署知情同意書。

8. NGS用于研究與診斷的區(qū)別：

由于技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用單位的能力提升，NGS用于研究或是診斷的界限已經(jīng)模糊，但在實際應(yīng)用中，應(yīng)該明確特定的NGS測試是用于研究還是診斷。診斷目的的NGS檢測是為了回答臨床患者腫瘤中是否具有特定的基因變異狀態(tài)（可作用靶點的變異）。診斷檢測通常是在一個得到認證的實驗室開展。而研究目的的NGS檢測是研究假設(shè)驅(qū)動的檢測，檢測結(jié)果對入組患者通常只具有有限或不確定的臨床意義。全外顯子或基因組測序的診斷結(jié)果由于數(shù)據(jù)量大，除了滿足特定的基因診斷，其他數(shù)據(jù)也可能產(chǎn)生新的研究假設(shè)。

聲明35：研究項目獲得有臨床意義的分子變異結(jié)果需要進一步在診斷條件下確證后才可以納入患者的醫(yī)療記錄。

聲明36：研究和診斷的檢測結(jié)果都應(yīng)該建立數(shù)據(jù)庫管理，以便于與本地、區(qū)域性的、國家或國際的數(shù)據(jù)庫進行比對分析，這有助于對變異進行臨床分類。

9. CAGC POI項目NGS測試（Test）的監(jiān)督管理

對于應(yīng)用于CAGC POI臨床實踐、試驗或研究的NGS檢測項目，為高效質(zhì)量的同一性和延續(xù)性，將由CSCO CAGC專家組對所測試的NGS項目進行監(jiān)督管理，管理方式包括現(xiàn)場考察、管理文件和流程監(jiān)督、測試樣本的室間評比等。目的是使得參與CAGC POI項目的各個NGS實驗室能夠達到統(tǒng)一的質(zhì)量標準。
 

參考文獻：

[1] Matthijs G, Souche E, Alders M, Corveleyn A, Eck S, Feenstra I, Race V, Sistermans E, Sturm M, Weiss M, Yntema H, Bakker E, Scheffer H, Bauer P. Guidelines for diagnostic next-generation sequencing. Eur J Hum Genet. 2016 Jan;24(1):2-5

[2] Luthra R, Chen H, Roy-Chowdhuri S, Singh RR. Next-Generation Sequencing in Clinical Molecular Diagnostics of Cancer: Advantages and Challenges. Cancers (Basel). 2015 Oct 14;7(4):2023-36

[3] Oliver GR, Hart SN, Klee EW. Bioinformatics for clinical next generation sequencing. Clin Chem. 2015 Jan;61(1):124-35.

[4] Vrijenhoek T, Kraaijeveld K, Elferink M, de Ligt J, Kranendonk E, Santen G, Nijman IJ, Butler D, Claes G, Costessi A, Dorlijn W, van Eyndhoven W, Halley DJ, van den Hout MC, van Hove S, Johansson LF, Jongbloed JD, Kamps R, Kockx CE, de Koning B, Kriek M, Deprez RL, Lunstroo H, Mannens M, Mook OR, Nelen M, Ploem C, Rijnen M, Saris JJ, Sinke R, Sistermans E, van Slegtenhorst M, Sleutels F, van der Stoep N, van Tienhoven M, Vermaat M, Vogel M, Waisfisz Q, Weiss JM, van den Wijngaard A, van Workum W, Ijntema H, van der Zwaag B, van IJcken WF, den Dunnen JT, Veltman JA, Hennekam R, Cuppen E. Next-generation sequencing-based genome diagnostics across clinical genetics centers: implementation choices and their effects. Eur J Hum Genet. 2015 Sep;23(9):1270

[5] Molecular Methods for Clinical Genetics and Oncology Testing; Approved Guideline—Third Edition MM01-A3

[6] Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved GuidelineMM13-A

[7] Quality Management for Molecular Genetic Testing; Approved Guideline MM20-A

[8] Comparison of immunohistochemistry with fluorescence in situ hybridization in determining the human epidermal growth factor receptor 2 status of breast cancer specimens: a multicenter study of 3 149 Chinese patients. Chin Med J 2014;127 (2): 246-253

[9] Frampton GM, Fichtenholtz A, Otto GA, Wang K, et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nat Biotechnol. 2013 Nov;31(11):1023-31.

[10] 詹啟敏, 曾益新, 王玨, 姬云, 錢海利, 李曉燕, 孫石磊.《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》.

[11] 李艷，李金明. 《個體化醫(yī)療中的臨床分子診斷》 人民衛(wèi)生出版社 2013年8月

[12] NCCN臨床實踐指南：非小細胞肺癌（2016.V1）

[13] NCCN臨床實踐指南：結(jié)直腸癌（2016.V1）

[14] NCCN臨床實踐指南：乳腺癌（2016.V1）

[15] NCCN臨床實踐指南：肝癌（2016.V1）

[16] NCCN臨床實踐指南：胃癌（2016.V1）

[17] NCCN臨床實踐指南：白血?。?016.V1）

附件：

[1] NGS檢測報告格式化模板

[2] 基因名稱及基因突變的標準術(shù)語（NGS技術(shù)相關(guān)的標準術(shù)語、NGS數(shù)據(jù)生物信息學(xué)所涉及的標準術(shù)語。中英文對照）

[3] 臨床腫瘤NGS診斷項目（test）的技術(shù)要求和質(zhì)控

[4] CAGC 2015年度啟動會議紀要